Dernières nouvelles

Southwire Bi

Milwaukee Hole Dozer avec scies cloches à dents en carbure

Dec 19, 2023

Examen de la scie cloche Disston QuickCore

May 31, 2023

Rencontrez les pilotes maritimes guidant d'énormes navires dans le port notoirement difficile de Saint John

Jun 09, 2023

La Chine creuse un 10 000

May 20, 2023

Intérêt clinique du remdesivir chez les macaques rhésus infectés par le SRAS

Aug 11, 2023

Nature volume 585, pages 273–276 (2020)Citer cet article

44 000 accès

396 Citations

768 Altmétrique

Détails des métriques

Des thérapies efficaces pour traiter la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) sont nécessaires de toute urgence. Alors que de nombreux médicaments expérimentaux, approuvés et réutilisés ont été suggérés comme traitements potentiels, les données précliniques provenant de modèles animaux peuvent guider la recherche de traitements efficaces en excluant ceux qui manquent d'efficacité in vivo. Le remdesivir (GS-5734) est un promédicament analogue de nucléotide doté d'une large activité antivirale1,2 qui fait actuellement l'objet d'essais cliniques sur la COVID-19 et a récemment reçu une autorisation d'utilisation d'urgence de la Food and Drug Administration des États-Unis3,4. Dans des modèles animaux, le remdesivir était efficace contre l'infection par le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) et le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV)2,5,6. In vitro, le remdesivir a inhibé la réplication du SARS-CoV-27,8. Ici, nous étudions l'efficacité du remdesivir dans un modèle macaque rhésus d'infection par le SRAS-CoV-29. Contrairement aux animaux traités avec le véhicule, les macaques traités au remdesivir n'ont pas montré de signes de maladie respiratoire ; ils ont également montré des infiltrats pulmonaires réduits sur les radiographies et des titres de virus réduits dans les lavages bronchoalvéolaires douze heures après la première dose. L'excrétion de virus par les voies respiratoires supérieures n'a pas été réduite par le traitement au remdesivir. À l'autopsie, les animaux traités au remdesivir présentaient des charges virales pulmonaires plus faibles et des lésions pulmonaires réduites. Ainsi, un traitement par remdesivir initié tôt lors de l'infection a eu un bénéfice clinique chez les macaques rhésus infectés par le SARS-CoV-2. Bien que le modèle du macaque rhésus ne représente pas la maladie grave observée chez certains patients atteints de COVID-19, nos données soutiennent l'initiation précoce du traitement par remdesivir chez les patients atteints de COVID-19 pour prévenir la progression vers la pneumonie.

Nous avons récemment établi un modèle macaque rhésus d'infection par le SARS-CoV-29. Dans ce modèle, les macaques rhésus infectés développent une maladie respiratoire transitoire légère à modérée, avec des infiltrats pulmonaires visibles sur les radiographies et un schéma d'excrétion similaire à celui observé chez les patients atteints de COVID-19. Les signes cliniques observés et les charges virales élevées permettent de tester l'efficacité du traitement des antiviraux à action directe dans ce modèle.

Deux groupes de six macaques rhésus ont été inoculés avec la souche SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020. Douze heures après l'inoculation, un groupe a reçu 10 mg kg-1 de remdesivir intraveineux et l'autre groupe a été traité avec un volume égal de solution de véhicule (2 ml kg-1). Le traitement a été poursuivi 12 h après le premier traitement et toutes les 24 h par la suite avec une dose de 5 mg kg-1 de remdesivir ou un volume égal de solution véhicule (1 ml kg-1). La concentration de remdesivir a été déterminée dans le sérum prélevé 12 h après le traitement initial et 24 h après les doses suivantes (immédiatement avant l'administration de la dose suivante de traitement). Le remdesivir (promédicament GS-5734), son métabolite alanine en aval (GS-704277) et le nucléoside parent (GS-441524) ont été détectés dans le sérum de tous les animaux traités au remdesivir (Extended Data Fig. 1a). Les niveaux sériques du promédicament et des métabolites en aval étaient cohérents avec les niveaux plasmatiques précédemment publiés de ces composés chez des macaques rhésus sains, qui ont montré une courte demi-vie systémique pour le GS-5734 (0,39 h) entraînant une conversion transitoire en l'intermédiaire GS-704277 et persistance du produit GS-441524 en aval à des niveaux plasmatiques plus élevés10.

Les concentrations du métabolite GS-441524 ont été mesurées dans le tissu pulmonaire prélevé dans chaque lobe pulmonaire sept jours après l'inoculation (dpi) et 24 h après l'administration de la dernière dose de remdesivir ; le métabolite était facilement détectable chez tous les animaux traités au remdesivir. Le GS-441524 était généralement distribué dans les six lobes du poumon (Extended Data Fig. 1b). Le GS-704277 n'a pas été détecté dans le tissu pulmonaire. Bien que le métabolite pharmacologiquement actif du remdesivir soit le triphosphate de GS-441524, des échantillons d'homogénat pulmonaire dopés avec le métabolite triphosphate ont démontré une dégradation rapide du métabolite dans cette matrice (données non présentées). Les niveaux de GS-441524 ont été pris comme substitut de la charge tissulaire et suggèrent que la stratégie de dosage actuelle a délivré des métabolites de médicament aux sites de réplication du SRAS-CoV-2 chez les animaux infectés.

Après inoculation de SARS-CoV-2, les animaux se sont vu attribuer un score clinique quotidien basé sur une feuille de notation préétablie en aveugle. Douze heures après la première administration de remdesivir, les scores cliniques chez les animaux traités au remdesivir étaient significativement inférieurs à ceux des animaux témoins recevant la solution de véhicule. Cette différence de score clinique s'est maintenue tout au long de l'étude (Fig. 1a). Un seul des six animaux traités au remdesivir a présenté une légère dyspnée, alors qu'une tachypnée et une dyspnée ont été observées chez tous les témoins traités par le véhicule (tableau de données étendu 1). Les infiltrats pulmonaires radiographiques sont l'une des caractéristiques du COVID-19 chez l'homme. Les radiographies prises à 0, 1, 3, 5 et 7 dpi ont montré une atteinte significativement moindre du lobe pulmonaire et une infiltration pulmonaire moins sévère chez les animaux traités par le remdesivir que chez ceux traités par le véhicule (Fig. 1b, c).

a, Scores cliniques quotidiens pour les animaux infectés par le SRAS-CoV-2 et traités avec du remdesivir (cercles rouges, n = 6) ou une solution véhicule (carrés noirs, n = 6). b, scores radiographiques cumulés. Les radiographies ventrodorsales et latérales ont été notées pour la présence d'infiltrats pulmonaires par un vétérinaire clinique selon un système de notation standard (0, normal ; 1, infiltrats pulmonaires interstitiels légers ; 2, infiltrats pulmonaires modérés, peut-être avec effacement partiel du bord cardiaque et petites zones de consolidation ; 3, infiltrats interstitiels sévères, vastes zones de consolidation pulmonaire, tracés alvéolaires et bronchogrammes aériens). Les lobes individuels ont été notés et les scores par animal et par jour ont été totalisés et affichés. c, Radiographies ventrodorsales de chaque animal prises en 7 dpi. Les zones d'infiltration pulmonaire sont encerclées. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test de comparaisons multiples de Sidak.

A 1, 3 et 7 dpi, un lavage bronchoalvéolaire (BAL) a été réalisé comme indicateur de la réplication du virus dans les voies respiratoires inférieures. Bien que les charges virales dans le BAL aient été réduites chez les animaux traités par le remdesivir, cette différence n'était pas statistiquement significative (Fig. 2a). Cependant, 12 h après l'administration du premier traitement au remdesivir, le titre de virus infectieux dans le BAL était environ 100 fois plus faible chez les animaux traités au remdesivir que chez les témoins. À 3 jours par pouce, le virus infectieux ne pouvait plus être détecté dans le BAL des animaux traités au remdesivir, alors que le virus était toujours détecté dans le BAL de quatre des six animaux témoins (Fig. 2b). Malgré cette réduction de la réplication du virus dans les voies respiratoires inférieures, il n'y a pas eu de réduction de la charge virale ou du titre de virus infectieux dans le nez, la gorge ou les écouvillons rectaux prélevés sur des animaux traités au remdesivir, à l'exception d'une différence significative du titre du virus dans les écouvillons de gorge prélevés sur 1 dpi et dans les charges virales dans les écouvillons de gorge collectés sur 4 dpi (Extended Data Fig. 2).

a, b, Charges virales (a) et titres de virus infectieux dans le BAL (b) prélevés sur des macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 et traités avec du remdesivir (n = 6) ou une solution véhicule (n = 6). TCID50, dose infectieuse de culture tissulaire à 50 %. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'une ANOVA à deux voies avec le test de comparaisons multiples de Sidak. c, charges virales dans les tissus prélevés dans les six lobes pulmonaires à l'autopsie à 7 dpi de macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 et traités avec du remdesivir (n = 6) ou une solution véhicule (n = 6). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un test t non apparié. Barres centrales, médiane.

Tous les animaux ont été euthanasiés à 7 dpi. Des échantillons de tissus ont été prélevés dans chaque lobe pulmonaire pour comparer la réplication du virus entre les animaux traités au remdesivir et les animaux traités au véhicule. Dans 10 des 36 échantillons de lobes pulmonaires prélevés sur des animaux traités au remdesivir, l'ARN viral n'a pas pu être détecté, alors que ce n'était le cas que dans 3 des 36 lobes pulmonaires prélevés sur des animaux témoins. En général, la comparaison entre les lobes pulmonaires individuels des deux groupes a montré une moyenne géométrique inférieure de l'ARN viral dans le groupe traité par le remdesivir (données étendues Fig. 3a). Ensemble, ces données montrent que la charge virale était significativement plus faible dans les poumons des animaux traités au remdesivir que dans ceux des témoins traités au véhicule (Fig. 2c). Le virus a pu être isolé des lobes pulmonaires de cinq des six animaux témoins traités par le véhicule, mais pas des tissus pulmonaires prélevés sur les animaux traités au remdesivir. Bien que la PCR quantitative avec transcription inverse (qRT-PCR) ait montré que moins de tissus provenant d'autres positions des voies respiratoires étaient positifs pour l'ARN viral chez les animaux traités au remdesivir que chez les témoins, ces différences n'étaient pas statistiquement significatives (Extended Data Fig. 3b).

A l'autopsie à 7 dpi, les poumons ont été évalués grossièrement pour les lésions. Des lésions pulmonaires macroscopiques ont été observées chez un des six animaux traités au remdesivir. En revanche, les six animaux témoins traités avec le véhicule présentaient des lésions visibles, entraînant une différence statistiquement significative dans la zone des poumons touchée par les lésions (Fig. 3a, b, Extended Data Fig. 4a, b). Cette différence était également évidente lors du calcul du rapport poids des poumons sur poids corporel comme indicateur de la pneumonie ; ce rapport était significativement plus faible chez les animaux traités au remdesivir que chez les animaux traités avec le véhicule (Extended Data Fig. 4c). Histologiquement, les animaux traités au remdesivir présentaient des lésions moins nombreuses et moins graves que les témoins traités au véhicule. Les lésions pulmonaires histologiques étaient absentes chez trois des six animaux traités au remdesivir ; les trois animaux restants ont développé une pathologie pulmonaire minimale. Les lésions chez ces animaux ont été caractérisées comme une pneumonie interstitielle minime largement séparée, fréquemment située dans les espaces sous-pleuraux (Fig. 3c, e). Cinq animaux sur six traités par le véhicule ont développé une pneumonie interstitielle multifocale légère à modérée (Fig. 3d, f). Nous avons détecté l'antigène viral dans un petit nombre de pneumocytes de type I et de type II et de macrophages alvéolaires chez tous les animaux, quel que soit le traitement (Fig. 3g, h).

Des macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 et traités avec du remdesivir (à gauche, n = 6) ou une solution véhicule (à droite, n = 6) ont été euthanasiés à 7 dpi. a, b, vues dorsales représentatives des poumons d'un animal traité au remdesivir (a) et d'un animal traité au véhicule avec des zones de consolidation focalement étendues (b, cercles). Une analyse histologique a été réalisée sur trois coupes de six lobes pulmonaires de chacun des six animaux par groupe de traitement et des images représentatives ont été choisies pour c–h. c, Pneumonie interstitielle sous-pleurale minimale (encadré) observée chez trois des six animaux traités au remdesivir. d, pneumonie interstitielle sous-pleurale modérée avec œdème (boîte) observée chez cinq des six animaux traités avec le véhicule. e, zone encadrée à partir de c avec des alvéoles bordées de pneumocytes de type II (flèche) et des espaces alvéolaires contenant des macrophages mousseux (tête de flèche). f, zone encadrée à partir de d avec interstitium pulmonaire élargi par un œdème et un nombre modéré de macrophages et de neutrophiles. Les alvéoles sont bordées de pneumocytes de type II (flèches). Les espaces alvéolaires sont remplis d'œdème (astérisque) et d'un petit nombre de macrophages pulmonaires (tête de flèche). g, Antigène viral dans les pneumocytes de type I (flèche) et les pneumocytes de type II (tête de flèche) d'un animal traité au remdesivir. h, antigène viral dans les pneumocytes de type I (flèche) et les macrophages (tête de flèche) d'un animal traité avec le véhicule. Barres d'échelle : c, d, 200 μm ; e–h, 20 μm.

Nous avons réalisé avec succès un séquençage en profondeur sur des échantillons de tous les animaux traités au remdesivir et des témoins traités au véhicule. Les mutations connues de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN qui confèrent une résistance au remdesivir dans les coronavirus11 n'ont été détectées dans aucun des échantillons testés (tableau supplémentaire 1).

Le remdesivir est, à notre connaissance, le premier traitement antiviral à montrer une efficacité prouvée contre le SRAS-CoV-2 dans un modèle animal du COVID-19. Le traitement des macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 avec du remdesivir a réduit la maladie clinique et les dommages aux poumons. Le dosage du remdesivir utilisé chez le macaque rhésus est équivalent à celui utilisé chez l'homme ; cependant, en raison de la nature aiguë de la maladie chez les macaques rhésus, il est difficile de traduire directement le moment du traitement utilisé aux stades correspondants de la maladie chez l'homme. Dans notre étude, le traitement a été administré près du pic de réplication virale dans les poumons, comme indiqué par les charges virales dans les lavages bronchoalvéolaires et les premiers effets du traitement sur les signes cliniques et la réplication virale ont été observés dans les 12 h. L'efficacité des antiviraux à action directe contre les infections virales aiguës des voies respiratoires diminue généralement avec les retards dans l'initiation du traitement12. Ainsi, le traitement par remdesivir doit être initié le plus tôt possible chez les patients atteints de COVID-19 pour obtenir l'effet maximal du traitement.

Malgré l'absence de signes respiratoires évidents et la réplication réduite du virus dans les poumons des animaux traités au remdesivir, il n'y a pas eu de réduction de l'excrétion du virus. Cette constatation est très importante pour la prise en charge des patients, où une amélioration clinique ne doit pas être interprétée comme un manque de contagiosité. Bien que nous ayons montré que les métabolites du remdesivir se trouvent dans les voies respiratoires inférieures, les niveaux de médicament dans les voies respiratoires supérieures n'ont pas été caractérisés et de nouvelles formulations avec des voies alternatives d'administration du médicament devraient être envisagées pour améliorer la distribution dans les voies respiratoires supérieures, réduisant ainsi l'excrétion. et le risque potentiel de transmission. Cependant, comme la maladie COVID-19 grave résulte d'une infection virale des poumons, cet organe est la principale cible du traitement par remdesivir. La biodisponibilité et l'effet protecteur du remdesivir dans les poumons des macaques rhésus infectés soutiennent le traitement des patients COVID-19 avec le remdesivir. Le traitement au remdesivir n'a pas entraîné d'amélioration clinique dans un essai clinique avec des patients atteints de COVID-1913 sévère ; cependant, un autre essai clinique impliquant plus de patients a montré que le traitement au remdesivir entraînait une amélioration plus courte que chez les patients qui n'avaient reçu que des soins standard14. Nos résultats chez les macaques rhésus indiquent que le traitement par remdesivir doit être envisagé le plus tôt possible sur le plan clinique pour prévenir la progression vers la pneumonie chez les patients atteints de COVID-19.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux des Rocky Mountain Laboratories, NIH et réalisées par du personnel certifié dans un établissement accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC), conformément aux directives de l'institution pour l'utilisation des animaux, en suivant les lignes directrices et les principes de base du NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, de l'Animal Welfare Act, du United States Department of Agriculture et de la United States Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Des macaques rhésus ont été logés dans des cages individuelles adjacentes pour primates, permettant des interactions sociales, dans une pièce climatisée avec un cycle lumière-obscurité fixe (12 h de lumière - 12 h d'obscurité). Les animaux ont été surveillés au moins deux fois par jour tout au long de l'expérience. De la nourriture commerciale pour singe, des friandises et des fruits ont été fournis deux fois par jour par du personnel qualifié. L'eau était disponible ad libitum. L'enrichissement environnemental consistait en une variété d'interactions humaines, de manipulations, de jouets commerciaux, de vidéos et de musique. Le Comité institutionnel de biosécurité (IBC) a approuvé le travail avec des souches infectieuses de SRAS-CoV-2 dans des conditions BSL3. L'inactivation des échantillons a été effectuée conformément aux procédures opératoires standard approuvées par l'IBC pour le retrait des échantillons d'un confinement élevé.

Pour évaluer l'effet du traitement au remdesivir sur l'issue de la maladie du SRAS-CoV-2, nous avons utilisé le modèle macaque rhésus récemment établi de l'infection par le SRAS-CoV-2 qui entraîne une maladie transitoire des voies respiratoires inférieures9. Comme il s'agit d'un modèle avec peu de données a priori, il n'a pas été possible d'effectuer une analyse de puissance pour déterminer la taille du groupe. La taille de l'échantillon était donc basée sur l'expérience d'autres modèles de primates non humains de maladies respiratoires, principalement un modèle de macaque rhésus de MERS-CoV où n = 6 a donné une signification statistique. Douze animaux ont été répartis au hasard en deux groupes et inoculés comme décrit précédemment avec une dose totale de 2,6 × 106 TCID50 (dose infectieuse de culture tissulaire à 50 %) de la souche SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020 par voie intranasale, orale, oculaire et intratrachéale itinéraires. L'efficacité du traitement thérapeutique au remdesivir a été testée dans deux groupes de six macaques rhésus adultes (trois mâles et trois femelles chacun ; 3,6 à 5,7 kg). En raison de la nature aiguë du modèle SARS-CoV-2 chez les macaques rhésus, le traitement thérapeutique a été initié 12 h après l'inoculation avec le SARS-CoV-2 et poursuivi une fois par jour pendant 6 dpi. Un groupe de macaques rhésus a été traité avec une dose de charge de 10 mg/kg de remdesivir, suivie d'une dose d'entretien quotidienne de 5 mg/kg. L'autre groupe de six animaux a servi de témoins infectés et a reçu un volume de dose égal (c'est-à-dire 2 ml/kg de dose de charge et 1 ml/kg par la suite) de solution de véhicule (12 % de sulfobutyléther-β-cyclodextrine dans de l'eau et de l'acide chlorhydrique , pH 3,5) selon le même schéma de traitement. Ce schéma posologique chez les macaques rhésus imite la posologie quotidienne testée dans des études cliniques impliquant des patients atteints de COVID-19 et entraîne une exposition systémique similaire aux médicaments. Le traitement a été délivré sous la forme d'une injection intraveineuse en bolus (dose totale délivrée sur environ 5 min) administrée alternativement dans les veines céphaliques ou saphènes gauche ou droite. Bien que le traitement au remdesivir utilisé ici chez les macaques rhésus soit plus court que le traitement standard de 10 jours chez les patients, ce traitement plus court a été choisi pour permettre l'évaluation de la pathologie pulmonaire à un moment après l'inoculation où les infiltrats pulmonaires et la pneumonie interstitielle seraient toujours présents. Des données récentes d'essais cliniques ont montré qu'un traitement de 5 jours a un bénéfice clinique similaire à un traitement de 10 jours chez les patients atteints de COVID-1914.

Les animaux ont été observés deux fois par jour pour détecter les signes cliniques de la maladie à l'aide d'une feuille de notation standardisée comme décrit précédemment9 ; la même personne, qui ne connaissait pas l'affectation des groupes d'animaux, a évalué les animaux tout au long de l'étude. Le point final prédéterminé pour cette expérience était de 7 dpi. Des écouvillons du nez, de la gorge et du rectum ont été prélevés quotidiennement pendant l'administration du traitement. Les examens cliniques ont été réalisés à 0, 1, 3, 5 et 7 dpi sur des animaux anesthésiés. Les jours d'examen, des paramètres cliniques tels que le poids corporel, la température, l'oxymétrie de pouls, la tension artérielle et la fréquence respiratoire ont été recueillis, ainsi que des radiographies thoraciques dorso-ventrales et latérales. Les radiographies ont été analysées par un vétérinaire clinicien ignorant l'affectation des groupes d'animaux. A 1, 3 et 7 dpi, un BAL a été réalisé en utilisant 10 ml de solution saline stérile. Après la mort à 7 dpi, des nécropsies ont été réalisées sur les animaux. Le pourcentage de lésions pulmonaires macroscopiques a été noté par un pathologiste vétérinaire certifié par le conseil, aveuglé par l'affectation des groupes d'animaux et des échantillons des tissus suivants ont été prélevés : ganglion lymphatique cervical, conjonctive, muqueuse nasale, oropharynx, amygdale, trachée, tous les lobes pulmonaires , ganglion lymphatique médiastinal, bronches droite et gauche, cœur, foie, rate, rein, estomac, duodénum, jéjunum, iléon, caecum, côlon et vessie. L'analyse histopathologique des lames de tissus a été effectuée par un pathologiste vétérinaire certifié par le conseil, aveuglé par l'affectation des groupes d'animaux.

L'isolat SARS-CoV-2 nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)15 (Vero passage 3) a été gracieusement fourni par les Centers for Disease Control (CDC) et propagé une fois dans des cellules Vero E6 dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Sigma ) additionné de 2 % de sérum bovin fœtal (Gibco), 1 mM de l-glutamine (Gibco), 50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine (Gibco) (milieu d'isolement du virus). Le stock de virus utilisé était identique à 100 % à la séquence initiale GenBank déposée (MN985325.1) et aucun contaminant n'a été détecté. Les cellules VeroE6 ont été maintenues dans du DMEM additionné de 10 % de sérum de veau fœtal, 1 mM de l-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine.

Remdesivir (RDV; GS-5734) a été fabriqué chez Gilead Sciences par le Département de chimie des procédés (Alberta, Canada) dans des conditions de bonnes pratiques de fabrication (BPF). Le lot numéro 5734-BC-1P a été solubilisé dans 12 % de sulfobutyléther-β-cyclodextrine dans de l'eau et une solution de véhicule correspondante a été fournie au NIH.

La tributylamine a été achetée chez Millipore Sigma. L'eau de qualité LC-MS, l'acétone, le méthanol, l'isopropanol et l'acide acétique ont été achetés auprès de Fisher Scientific. Tous les étalons synthétiques pour l'analyse moléculaire ont été fournis par Gilead Sciences Inc. Le sérum et les homogénats pulmonaires nettoyés ont été irradiés aux rayons gamma (2 MRad) pour inactiver le virus infectieux potentiellement présent dans ces échantillons avant l'analyse. Des échantillons ont été préparés pour l'analyse de petites molécules en diluant une aliquote de 50 μl de sérum ou d'homogénat pulmonaire clarifié avec 950 μl d'acétone à 50 %, de méthanol à 35 %, d'eau à 15 % (v/v) sur de la glace. Les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 15 min puis centrifugés à 16 000 g pendant 5 min. Les surnageants clarifiés (850 µl) ont été récupérés et amenés à sec dans un concentrateur Savant DNA120 SpeedVac (Thermo Fisher). Les échantillons ont été remis en suspension dans 100 ul de 50 % de méthanol, 50 % d'eau (v/v) et centrifugés comme précédemment. Le surnageant a été prélevé dans un flacon d'échantillon pour analyse LC-MS. Les échantillons ont été séparés à l'aide d'une stratégie de chromatographie liquide par appariement d'ions sur un système Sciex ExionLC AC. Les échantillons ont été injectés sur une colonne Waters Atlantis T3 (100 Å, 3 μm, 3 mm × 100 mm) et élués à l'aide d'un gradient binaire de 5 mM de tributylamine, 5 mM d'acide acétique dans 2 % d'isopropanol, 5 % de méthanol, 93 % d'eau ( v/v) à 100 % d'isopropanol en 5,5 min. Les analytes ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre de masse Sciex 5500 QTRAP en mode négatif. La surveillance de plusieurs réactions a été effectuée à l'aide de deux paires de signaux pour chaque analyte et la fidélité du signal a été confirmée en collectant les spectres d'ions produits déclenchés et en les comparant aux spectres d'étalons synthétiquement purs.

Tous les analytes ont été quantifiés par rapport à une courbe d'étalonnage en huit points de l'étalon synthétique respectif préparé dans la matrice cible (c'est-à-dire, du sérum ou de l'homogénat pulmonaire nettoyé) et traités de la même manière que les échantillons expérimentaux. La limite de quantification (LOQ) a été approchée à un signal sur bruit de 10. Les LOQ pour les molécules mesurées dans chaque matrice étaient de 5 nM pour le GS-441524 dans l'homogénat pulmonaire et le sérum, de 1 nM pour le GS-704277 dans l'homogénat pulmonaire et sérum et 0,08 nM pour le GS-5734 dans le sérum. L'instabilité du GS-5734 et du métabolite nucléotidique triphosphorylé dans l'homogénat pulmonaire pendant la lyse tissulaire a empêché la détection de ces métabolites dans le tissu pulmonaire.

L'ARN a été extrait des écouvillons et du BAL à l'aide du kit QiaAmp Viral RNA (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Les tissus (30 mg) ont été homogénéisés dans du tampon RLT et l'ARN a été extrait à l'aide du kit RNeasy (Qiagen) selon les instructions du fabricant. Pour la détection de l'ARN viral, 5 μl d'ARN ont été utilisés dans un test RT-PCR E en temps réel en une étape à l'aide du kit de sonde Rotor-Gene (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. Dans chaque cycle, des dilutions standard d'étalons d'ARN comptés par PCR numérique de gouttelettes ont été exécutées en parallèle, pour calculer le nombre de copies dans les échantillons.

Les titrages de virus ont été effectués par titrage au point final dans des cellules Vero E6. Le tissu a été homogénéisé dans 1 ml de DMEM en utilisant un TissueLyser (Qiagen). Les cellules ont été inoculées avec des dilutions en série au 1/10 d'échantillons d'écouvillon et de BAL. L'isolement du virus a été réalisé sur des tissus pulmonaires en homogénéisant le tissu dans 1 ml de DMEM et en inoculant des cellules Vero E6 dans une plaque à 24 puits avec 250 ul d'homogénat clarifié et une dilution au 1:10 de celui-ci. Une heure après l'inoculation des cellules, l'inoculum a été retiré et remplacé par 100 μl (titrage du virus) ou 500 μl de milieu d'isolement du virus. Six jours après l'inoculation, le CPE a été noté et le TCID50 a été calculé.

L'histopathologie et l'immunohistochimie ont été réalisées sur des tissus de macaque rhésus. Après fixation pendant au moins 7 jours dans du formol tamponné neutre à 10 % et inclusion dans de la paraffine, les coupes de tissus ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Pour détecter l'antigène SARS-CoV-2, une immunohistochimie a été réalisée à l'aide d'un antisérum de lapin sur mesure contre le SARS-CoV-2 N à une dilution de 1:1 000. Les lames colorées ont été analysées par un pathologiste vétérinaire certifié.

L'ARN viral a été extrait comme décrit ci-dessus. Les ADNc ont été préparés comme décrit, avec des modifications mineures17. En bref, 3 à 12 μl d'ARN extrait ont été appauvris en ARNr à l'aide de Ribo-Zero Gold H/M/R (Illumina), puis transcrits à l'aide d'hexamères aléatoires et de SuperScript IV (ThermoFisher Scientific). Après le traitement à la RNaseH, la synthèse du deuxième brin a été réalisée à l'aide d'un fragment de Klenow (New England Biolabs) et les ADNc double brin résultants ont été traités avec un mélange combiné de RiboShredder RNase Blend (Lucigen) et de RNase, sans DNase, à haute concentration (Roche Diagnostics, Indianapolis , IN) puis purifié à l'aide de billes de purification Ampure XP (Beckman Coulter). Le kit de préparation de bibliothèques HyperPlus de Kapa (Roche Sequencing Solutions) a été utilisé pour préparer des bibliothèques de séquençage à partir des ADNc double brin. Pour faciliter le multiplexage, la ligature de l'adaptateur a été réalisée avec des adaptateurs KAPA Unique à double index et les échantillons ont été enrichis en produit ligaturé avec l'adaptateur à l'aide du mélange KAPA HiFi HotStart Ready et de sept cycles d'amplification PCR, conformément au manuel du fabricant. Des pools composés de huit bibliothèques d'échantillons ont été utilisés pour l'enrichissement du virus de capture hybride à l'aide du panel myBaits Expert Virus SARS-CoV-2 et en suivant le manuel du fabricant, version 4.01, avec 14 cycles d'amplification PCR post-capture (Arbor Biosciences). Les bibliothèques purifiées et enrichies ont été quantifiées à l'aide du kit Kapa Library Quantification (Roche Sequencing Solutions) et séquencées sous forme de lectures de 2 × 150 paires de bases sur l'instrument Illumina NextSeq 550 (Illumina).

Les lectures fastq brutes ont été coupées des séquences d'adaptateur Illumina à l'aide de la version 1.1218 de cutadapt, puis coupées et filtrées pour la qualité à l'aide du FASTX-Toolkit (Hannon Lab). Les lectures restantes ont été cartographiées sur le génome SARS-CoV-2 2019-nCoV/USA-WA1/2020 (MN985325.1) à l'aide de Bowtie2 version 2.2.919 avec les paramètres --local --no-mixed -X 1500. Les doublons de PCR ont été supprimés en utilisant picard MarkDuplicates (Broad Institute) et les variantes ont été appelées en utilisant GATK HaplotypeCaller version 4.1.2.020 avec le paramètre -ploïdy 2. Les variantes ont été filtrées pour QUAL> 1000 et DP> 20 en utilisant bcftools.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 8.2.1.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données incluses dans ce manuscrit ont été déposées dans Figshare (https://doi.org/10.35092/yhjc.12111570). Les séquences ont été déposées au NCBI sous le numéro d'accession BioProject PRJNA632475.

Lo, MK et al. Le GS-5734 et son analogue nucléosidique parent inhibent les Filo-, Pneumo- et Paramyxovirus. Sci. Rep. 7, 43395 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheahan, TP et al. L'antiviral à large spectre GS-5734 inhibe à la fois les coronavirus épidémiques et zoonotiques. Sci. Trad. Méd. 9, eaal3653 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

US National Library of Medicine Clinical Trials.gov (consulté le 15 mai 2020) ; https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=remdesivir&cntry=&state=&city=&dist=

Administration américaine des aliments et médicaments. Mise à jour sur le coronavirus (COVID-19) : la FDA délivre une autorisation d'utilisation d'urgence pour un traitement potentiel contre le COVID-19 https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-issues-emergency -utilisation-autorisation-potentiel-covid-19-traitement (2020).

de Wit, E. et al. Traitement prophylactique et thérapeutique au remdesivir (GS-5734) dans le modèle macaque rhésus de l'infection par le MERS-CoV. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 117, 6771–6776 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheahan, TP et al. Efficacité thérapeutique comparative du remdesivir et de l'association lopinavir, ritonavir et interféron bêta contre le MERS-CoV. Nat. Commun. 11, 222 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choy, KT et al. Le remdesivir, le lopinavir, l'émétine et l'homoharringtonine inhibent la réplication du SARS-CoV-2 in vitro. Antiviral Res. 178, 104786 (2020).