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Aug 02, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 366 (2023) Citer cet article

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La plasticité synaptique implique l'établissement et le réarrangement appropriés des microdomaines structurels et fonctionnels. Pourtant, la visualisation des signaux lipidiques sous-jacents s'est avérée difficile. En appliquant une combinaison de cryofixation rapide, de gel-fracturation membranaire, d'immunomarquage à l'or et de microscopie électronique, nous visualisons et déterminons quantitativement les changements et la distribution du phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) dans la membrane plasmique des épines dendritiques et de leurs sous-zones à ultra-haute résolution. Ces efforts démêlent les phases distinctes des signaux PIP2 lors de l'induction de la dépression à long terme (LTD). Au cours des premières minutes, PIP2 augmente rapidement de manière dépendante de PIP5K en formant des nanoclusters. PTEN contribue à une deuxième phase d'accumulation de PIP2. Les signaux PIP2 augmentés de manière transitoire sont limités aux têtes de la colonne vertébrale supérieure et moyenne. Enfin, la dégradation PIP2 dépendante du PLC fournit une terminaison rapide des signaux PIP2 pendant l'induction LTD. Ensemble, ce travail démêle les signaux spatiaux et temporels définis par PIP2 au cours de différentes phases après l'induction de LTD et dissèque les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dynamique PIP2 observée.

La majorité des postsynapses excitatrices du système nerveux central sont situées dans de petites saillies dendritiques, appelées épines dendritiques. Les processus de plasticité synaptique impliquant des changements dynamiques dans la structure et l'organisation des épines dendritiques sous-tendent la modulation de la force synaptique excitatrice et sont considérés comme la base de l'apprentissage et de la mémoire1,2. Au premier rang des modes de plasticité synaptique se trouve un processus appelé dépression à long terme (LTD), qui réduit la sensibilité et la réponse à un signal synaptique donné3. Au niveau moléculaire, la LTD implique l'élimination des récepteurs du glutamate de type acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) de l'échafaudage de densité post-synaptique par endocytose ou diffusion latérale ainsi que des réarrangements structurels du cytosquelette d'actine entraînant une réduction du volume de la colonne vertébrale3,4.

Au cours des dernières décennies, de grands progrès ont été réalisés dans l'identification et la caractérisation des machineries protéiques qui contrôlent et interviennent dans la plasticité de la colonne vertébrale dendritique. Pourtant, les connaissances sur l'implication des lipides membranaires - bien qu'ils soient des constituants majeurs de la membrane - sont encore rares et souvent controversées, voire contradictoires5,6. Les phosphoinositides sont connus pour interagir avec et réguler des protéines membranaires distinctes et avoir une variété de fonctions cellulaires7. Le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) et le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (ici pour simplifier appelé PIP2) sont les phosphoinositides les plus abondants dans les cellules. PIP2 est enrichi au niveau de la membrane plasmique, où il constitue moins d'un pour cent des phospholipides8. Dans les présynapses, les rôles cruciaux des phosphoinositides ont été bien établis et comprennent principalement des fonctions de trafic membranaire9,10,11,12. En revanche, l'importance physiologique et le rôle spécifique de PIP2 dans les postsynapses sont beaucoup moins compris et controversés.

Les concentrations de phosphoinositides individuels sont contrôlées par un ensemble complexe de phosphatases, kinases et lipases lipidiques spécifiques qui sont elles-mêmes les cibles d'une variété de voies de signalisation13,14. Les études portant sur un rôle putatif de PIP2 dans l'ILD, en particulier, reposaient en grande partie sur la manipulation de ces enzymes métaboliques et ont donné des résultats contradictoires15,16,17,18,19,20. Les raisons des divergences (apparentes) peuvent dans une large mesure inclure l'incapacité de fixer et de visualiser directement PIP2 au niveau des épines postsynaptiques sans modifier sa distribution et sa disponibilité non perturbée en tant que signal lipidique.

Les synapses ont des exigences fonctionnelles et structurelles particulières pour la compartimentation, telles qu'établies par des nanodomaines membranaires distincts. De plus, ces nanodomaines de la membrane synaptique nécessitent la capacité de s'adapter plastiquement lors des réarrangements post-synaptiques. Pour suivre l'hypothèse selon laquelle ces réarrangements au cours de la LTD pourraient être provoqués par des signaux temporels et spatiaux définis par l'importante molécule de signalisation PIP2, nous avons appliqué la cryofixation rapide, la congélation-fracturation de la membrane, le marquage immunogold et la microscopie électronique à transmission (TEM) pour visualiser et évaluer quantitativement la distribution de PIP2 dans la membrane plasmique des épines dendritiques et dans différentes sous-zones de celle-ci à ultra haute résolution. Nous dévoilons ainsi les signaux spatiaux et temporels définis par PIP2 au cours des différentes phases après l'induction de LTD et disséquons les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dynamique PIP2 observée.

Des études antérieures tentant de démêler les implications des signaux de signalisation PIP2 dans les membranes de la colonne vertébrale dendritique au cours de la LTD ont donné des résultats contradictoires16,19. Comme des divergences apparentes peuvent avoir été causées par un manque de préservation de la distribution de PIP2, par une désactivation artificielle de PIP2, par une résolution insuffisante et/ou par d'autres limitations, nous avons cherché à mettre en place un immunomarquage anti-PIP2 de membranes fracturées par congélation rapidement cryoconservées. analysé par TEM. Les liposomes avec PIP2, phosphatidylsérine (PS), PI(3,4,5)P3 (PIP3) ou PI(3,4)P2 ont été congelés rapidement dans du propane/éthane refroidi à l'azote liquide, fracturés par congélation et incubés avec des anticorps secondaires anti-PIP2 et couplés à l'or pour déterminer s'il est possible de préserver et de détecter le lipide signal PIP2 dans un environnement membranaire. En effet, les examens au microscope électronique des liposomes avec PIP2 ajouté ont montré un marquage immuno-or fréquent (29, 32 particules d'or / µm2), contrairement aux liposomes témoins (Fig. 1a – d). Des évaluations quantitatives ont montré que les liposomes avec PIP2 ajouté présentaient une densité de marquage immunogold plus de 12 fois supérieure à celle des liposomes témoins, qui offraient simplement un surplus de groupes de tête lipidiques non apparentés et chargés négativement sous forme d'ajout de PS (Fig. 1e; Fig supplémentaire 1). Ces résultats ont clairement démontré qu'il est en principe possible de détecter la PIP2 cryoconservée dans un environnement lipidique intact.

a Images TEM représentatives d'une réplique de fracture par congélation marquée à l'immunogold anti-PIP2 de liposomes composés de 65 % (p/v) de PE, 30 % (p/v) de PC et 5 % (p/v) de PI(4, 5)P2 (PIP2) (a), PS (b), PI(3,4,5)P3 (PIP3) (c), ou PI(3,4)P2 (d). Les pointes de flèche mettent en évidence des exemples d'étiquettes dorées. Barres, 200 nm. e Analyses quantitatives des densités de marquage. PI(4,5)P2, n = 25 ; PS, n = 35 ; PI(3,4,5)P3, n = 21 ; PI(3,4)P2, n = 21 (pour la présentation graphique à barres/points des données quantitatives en e, voir la figure supplémentaire 1). f–o Images TEM (f, f', f", h–j, l–n) et analyses quantitatives (g, k, o) des marquages ​​immunogold anti-PIP2 des membranes plasmiques de soma fracturées par congélation (f, f ', f", g) et les dendrites (h–n) des neurones de l'hippocampe (DIV14-16). Les évaluations de surface de contrôle (face E, glace) (g – k) et les expériences de contrôle avec des anticorps désactivés pour une liaison spécifique par préincubation avec des liposomes contenant PIP2 (i, k) ont démontré la spécificité du marquage. (l – o) Expériences quantitatives supplémentaires avec différentes dilutions d'anticorps anti-PIP2 établissant une dilution d'anticorps de 1:100 comme produisant une détection PIP2 saturée. Barres, 200 nm. Soma P-face, n = 20 ; soma E-face, n = 12 ; glace, n = 14 ROI. Dendrites : face P, n = 40 ; Face E, n = 37 ; glace, n = 41 ; trempe (face P), n = 41 ROI. Dendrites (faces P) marquées avec différentes dilutions d'anticorps : 1:200, n = 78 ; 1:100, n = 78 ; 1:50, n = 82 ROI. Données, moyenne ± SEM d'au moins deux tests indépendants chacun. Calculs de signification statistique, ANOVA à un facteur/Test de comparaison multiple de Tukey (g), Kruskal–Wallis/Dunn (e, k, o). *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001. Pour P < 0,0001, les valeurs P exactes ne sont pas disponibles. Les autres valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

D'autres expériences ont montré que ni PIP3 ni PI(3,4)P2 n'étaient reconnus par les anticorps anti-PIP2 (Fig. 1c, d). Les densités de marquage observées à ces deux contrôles supplémentaires étaient très faibles et ne dépassaient pas celles de PS (Fig. 1e; Fig. 1 supplémentaire). Ainsi, ni les inositides en général ni un phosphoinositide contenant toutes les caractéristiques antigéniques potentielles également présentes dans PIP2 mais offrant un phosphate supplémentaire (PIP3) ou un phosphoinositide affichant toutes les caractéristiques de PIP2 mais présentant un groupe phosphate dans une position différente (PI(3,4) P2) ont été reconnus par les anticorps anti-PIP2. L'immunodétection établie était donc clairement spécifique de PIP2.

Les déterminations quantitatives des densités de marquage avec différentes tailles d'anticorps secondaires recouverts d'or colloïdal ont montré que les immunomarquages ​​anti-PIP2 des membranes fracturées par congélation ne dépendaient pas fortement de la taille des particules d'or (Fig. 2 supplémentaire). Cela était conforme aux observations précédentes de faibles encombrements stériques des sondes à base de protéines au niveau des membranes fracturées par congélation21.

Bien qu'étant de morphologie délicate, les neurones cultivés cultivés sur des disques de saphir peuvent en principe être cryoconservés et congelés, ce qui permet le marquage immunogold des protéines associées à la membrane, telles que la protéine F-BAR syndapine I22,23 (PACSIN 1) et la Protéine N-Ank ankycorbin24 (RAI14). Des neurones primaires de rat cultivés pendant 16 jours (DIV16) sur du saphir ont montré des morphologies post-synaptiques normales, notamment des dendrites, des épines dendritiques et leurs sous-structures22. Nous avons donc testé si la combinaison de la cryoconservation, de la congélation-fracturation, du marquage immunogold et du TEM des protéines membranaires pouvait être considérablement étendue à la détection du lipide signal PIP2 dans son environnement membranaire cellulaire naturel (Fig. 1f – k). Des grossissements à haute puissance des zones de membrane plasmique fracturées par congélation du soma ont montré un marquage immunogold anti-PIP2 fréquent (Fig. 1f – f "). Le marquage immunogold a été trouvé à différentes topologies membranaires et était dans une certaine mesure regroupé. Les grappes de marquage détecté avait généralement un diamètre relativement uniforme ne dépassant pas 100 nm et contenait un maximum de 10 marqueurs (Fig. 1f – f ").

Le marquage était très spécifique, car la face P (face protoplasmique de la membrane plasmique fracturée) de la membrane représentant l'interface cytosolique présentait une densité de marquage moyenne de 24,2 particules d'or/µm2, alors que les surfaces de contrôle intrinsèques à l'intérieur de l'échantillon présentaient un très faible marquage. densités (face soma E (face exoplasmique de la membrane plasmique fracturée), 3,0/µm;2 glace, 0,6/µm2) (Fig. 1g). Ces observations sont cohérentes avec le fait que PIP2 est principalement présent dans le feuillet interne de la membrane plasmique25.

Étonnamment, dans le même échantillon et les mêmes immunomarquages, la densité de marquage PIP2 des zones de la membrane dendritique était bien inférieure au marquage très abondant dans la membrane plasmique somatique (Fig. 1h – k). Dans les zones de membrane dendritique, la densité de marquage n'a atteint que 6,3 particules/µm2. Elle n'était donc qu'à peu près le quart de celle des surfaces membranaires somatiques.

Il est important de noter que cette détection PIP2 dendritique beaucoup plus faible était clairement spécifique, car la face E dendritique et les surfaces de glace ne présentaient presque aucun marquage. De plus, des expériences d'extinction d'anticorps avec des liposomes contenant PIP2 ont également entraîné un marquage très clairsemé des membranes plasmiques dendritiques fracturées par congélation (Fig. 1i – k).

Afin d'étudier de manière fiable l'occurrence, l'intensité, la dynamique et la décroissance des signaux PIP2 avec une résolution ultra-élevée, il était ensuite important de déterminer la dilution d'anticorps détectant la quantité maximale de PIP2 sans liaison non spécifique putative due à un excès d'anticorps. En incubant des aliquotes de la même réplique de congélation-fracture avec différentes dilutions d'anticorps, nous avons observé que la saturation était atteinte à 1: 100 (Fig. 1l – o).

Le marquage anti-PIP2 validé et optimisé nous a permis de mener ensuite des examens quantitatifs à ultra-haute résolution de la localisation non perturbée de PIP2 dans des zones de membrane plasmique cryoconservées et fracturées par congélation de la tonnelle dendritique des neurones hippocampiques matures. Comme démontré précédemment, il est en principe possible de préserver non seulement les dendrites mais aussi les épines dendritiques pendant la cryofracturation et les préparations d'échantillons ultérieures pour la microscopie électronique et de les classer et de les affecter aux sous-classes distinctes22. Nous avons concentré nos analyses quantitatives sur les épines de type champignon, c'est-à-dire sur les épines avec une tête clairement discernable, car les épines de champignon constituent la grande majorité des épines du cerveau, contiennent des structures post-synaptiques matures et sont donc d'une importance physiologique de la plus haute importance1,2 (dans ce qui suit simplement appelé épines). Les épines dendritiques en filigrane dépassant des dendrites et leurs sous-structures se sont avérées gelées avec des taux suffisants et ont été immunomarquées anti-PIP2 (Fig. 2a – c). Les analyses quantitatives ont montré que la densité d'immunomarquage anti-PIP2 dans les épines systématiquement échantillonnées (c'est-à-dire également les profils zéro inclus) était supérieure (P = 0, 0062) à la densité de marquage moyenne des zones dendritiques adjacentes (Fig. 2d).

a–c Images TEM (a, b) d'une colonne vertébrale dendritique anti-PIP2 immunogold marquée d'un neurone hippocampique fracturé par congélation (DIV16) avec colonne vertébrale soulignée et coloration transparente de la dendrite (bleu), base de la colonne vertébrale (vert), col de la colonne vertébrale (jaune) et la tête de la colonne vertébrale (rouge) (a), comme illustré schématiquement en c, et l'image TEM brute correspondante (b). Barres, 200 nm. d, e Analyses quantitatives des densités de marquage immunogold anti-PIP2 des zones de membrane plasmique de la colonne vertébrale dendritique par rapport aux zones dendritiques (d) et des zones sous-épineuses (e), respectivement. Données, moyenne ± SEM de 16 tests indépendants ; n = 159 ROI chacune (dendrite, colonne vertébrale totale, base de la colonne vertébrale, cou et tête). Calculs de signification statistique, Mann–Whitney (d) et Kruskal–Wallis/Dunn (e). **P < 0,01 ; ****P < 0,0001. Pour P < 0,0001, les valeurs P exactes ne sont pas disponibles. L'autre valeur P est indiquée dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

Au sein des épines, la tête de la colonne vertébrale a montré un fort enrichissement en PIP2 sur le cou et en particulier la base (les deux P < 0,0001 ; ****). La densité moyenne d'immunomarquage anti-PIP2 dans les têtes de colonne vertébrale au repos était de 6,5 ± 0,6 particules/µm2 contre 2,9 ± 0,7 particules/µm2 et 4,6 ± 1,3 particules/µm2 dans la base et le cou, respectivement. La densité de marquage de PIP2 dans la membrane plasmique de la tête de la colonne vertébrale était donc plus de deux fois supérieure à celle des zones de la base de la colonne vertébrale. (Fig. 2e).

Ces différences frappantes ont révélé que même à l'état d'équilibre, en particulier les têtes des épines dendritiques sont des zones importantes de signaux PIP2 dans la tonnelle dendritique des neurones matures.

Induction de LTD par incubations avec 50 µM de N-méthyl-D-aspartate (NMDA) pendant jusqu'à 3 min et silence présynaptique (préincubation de tétrodotoxine (TTX) 2 µM)26,27,28,29,30,31 suivi d'une chasse période dans un milieu préconditionné et une congélation rapide ultérieure à des intervalles de temps distincts ont démontré que PIP2 peut être détecté dans les dendrites ainsi que dans les épines dendritiques avant et après l'induction de LTD (Fig. 3a – h). Des évaluations quantitatives au microscope électronique ont révélé que, alors que les densités de marquage PIP2 dans les zones dendritiques (même celles entourant les épines dendritiques) ne changeaient pas de manière significative au fil du temps (Fig. 3i), la membrane plasmique des épines dendritiques montrait une augmentation rapide et hautement statistiquement significative de PIP2. densité (P = 0,0049 (**)) 2 min en stimulation NMDA. Les niveaux de PIP2 dans les épines dendritiques au cours de cette première phase ont atteint 180% des niveaux de PIP2 avant l'induction de LTD par NMDA (Fig. 3j).

Images TEM a–h d'épines dendritiques immunomarquées anti-PIP2 (décrites) de neurones hippocampiques fracturés par congélation (DIV14-16) à l'état d'équilibre (0 min) et à différents moments pendant et après l'induction de LTD par incubation avec 50 µM de NMDA pendant 3 min et remise en place ultérieure dans un milieu préconditionné. Barres, 200 nm. i–k Déterminations quantitatives des densités de marquage immunogold anti-PIP2 à différents temps de traitement pendant et après l'induction de LTD déterminées dans les dendrites (i), dans les épines totales (j) et dans les trois sous-domaines différents de la colonne vertébrale (k) exprimées en pourcentage de la moyenne densité d'étiquetage des données totales de la colonne vertébrale à 0 min (état d'équilibre) dans chaque essai. Trois phases apparentes de réponses de signalisation PIP2 dans les épines dendritiques pendant et après l'induction de LTD sont mises en évidence par coloration (jaune, phase 1, première augmentation rapide de la densité PIP2 ; vert, deuxième phase d'augmentation des signaux PIP2 dans la membrane plasmique de la colonne vertébrale (tête) jusqu'à un maximum est atteint à 10 min ; bleu, phase 3, puis diminution des signaux PIP2 dans la colonne vertébrale (tête)). Pour une comparaison des données absolues pour 0 et 3 + 7 min non normalisées par rapport aux contrôles respectifs avec les données correspondantes obtenues d'un expérimentateur indépendant et non formé, voir Fig. 3 supplémentaire. (i – k) Données, moyenne ± SEM. 0 min, n = 159 ; 1 min, n = 36 ; 2 min, n = 53 ; 3 min, n = 49 ; 5 (3 + 2) min, n = 50 ; 10 (3 + 7) min, n = 59 ; 15 (3 + 12) min, n = 44 ; 30 (3 + 27) min, n = 35 retours sur investissement chacun (dendrite ; colonne vertébrale totale ; sous-domaines de la colonne vertébrale, base, cou et tête) de 3 à 16 tests indépendants avec des temps d'incubation différents. Calculs de signification statistique, tests de Kruskal–Wallis/Dunn (i–k ; **P < 0,01 ; ****P < 0,0001) et tests de Mann–Whitney pendant 3 contre 10 min et 10 contre 30 min (j ; ## P < 0,01) (j). Pour P < 0,0001, les valeurs P exactes ne sont pas disponibles. Les autres valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

Cette première phase a été suivie d'une seconde augmentation plus lente des niveaux de PIP2 atteignant son pic 10 min après le début de l'induction LTD. Sur l'ensemble du rachis, le maximum de cette deuxième phase était marqué par des signaux PIP2 plus de deux fois plus élevés (220%) que les niveaux PIP2 à l'état d'équilibre (Fig. 3j). Cette découverte clé a ensuite été confirmée par des évaluations supplémentaires par un expérimentateur indépendant. Il est important de noter que ces efforts ont conduit à pratiquement les mêmes données pour la sélection de la colonne vertébrale, les déterminations de la zone de la colonne vertébrale et le nombre d'étiquetages et ont donc également produit des données pratiquement identiques sur les densités d'étiquetage (Fig. 3 supplémentaire).

Par la suite, les niveaux de PIP2 ont chuté. Après 30 min, ils ont presque atteint les niveaux de prétraitement. Ce déclin constituait ainsi une autre, une troisième phase distincte des signaux PIP2 lors de l'induction LTD dans les épines dendritiques (Fig. 3j).

Fait intéressant, des enquêtes spatiales plus détaillées ont révélé que c'était exclusivement la membrane de la tête de la colonne vertébrale, mais pas les zones membranaires de la base de la colonne vertébrale ou du cou, qui affichaient les augmentations des niveaux de PIP2 pendant les phases 1 et 2 lorsqu'elles étaient normalisées aux données respectives de 0 min ( figure 3k). Dans la membrane de la tête de la colonne vertébrale, la densité de marquage PIP2 était supérieure à 230% des niveaux à l'état d'équilibre pendant la phase 1 et plus de trois fois plus élevée pendant la phase 2 (Fig. 3k).

La base de la colonne vertébrale et les zones de la membrane dendritique entourant la colonne vertébrale ont toutes deux montré une certaine tendance à une augmentation des niveaux de PIP2 indiquant une certaine diffusion 2D de PIP2 hors des zones de la membrane vertébrale au cours de la phase tardive de l'induction de LTD, mais ces deux tendances étaient mineures et sont restées statistiquement insignifiant (Fig. 3i, k). La baisse globale des niveaux de PIP2 dans la colonne vertébrale totale en phase 3 (Fig. 3j) était principalement attribuable aux changements des niveaux de PIP2 dans la tête de la colonne vertébrale. Trente minutes après le début de l'induction de LTD, les niveaux de PIP2 dans les membranes de la tête de la colonne vertébrale étaient revenus aux niveaux de prétraitement (Fig. 3k).

La tête de la colonne vertébrale subit divers changements structurels au cours de la LTD, qui impliqueraient potentiellement différents sous-domaines de la colonne vertébrale. La mesure de la hauteur de chaque tête de colonne vertébrale et sa division en trois zones de largeur égale (Fig. 4a) ont révélé que la distribution des signaux PIP2 n'était pas égale mais montrait des comportements et une cinétique très distincts dans les trois sous-domaines de la tête. Une augmentation importante de PIP2 après le traitement au NMDA a pu être observée dans la partie supérieure de la tête (Fig. 4b). Les signaux PIP2 ont rapidement atteint environ 250 % de ceux à l'état d'équilibre pendant la première phase. Ils ont continué à augmenter pour atteindre plus de 350 % au cours de la deuxième phase. De même, de fortes augmentations des niveaux de PIP2 ont été observées dans la zone médiane de la tête (Fig. 4c; Fig. Supplémentaire 3k, l).

Les têtes de la colonne vertébrale ont été subdivisées en tête inférieure, moyenne et supérieure selon le schéma (a). Analyses quantitatives des densités de marquage PIP2 dans les neurones DIV14-16 après traitement au NMDA (voir Fig. 3) dans la tête supérieure (b), moyenne (c) et inférieure (d). Les analyses quantitatives sont basées sur les données totales de la colonne vertébrale à 0 min (état stable) dans chaque essai. Pour une comparaison des données absolues pour 0 et 3 + 7 min non normalisées par rapport aux contrôles respectifs avec les données correspondantes obtenues auprès d'un expérimentateur indépendant et non formé, voir la Fig. 3 supplémentaire. 0 min, n = 159 ; 1 min, n = 36 ; 2 min, n = 53 ; 3 min, n = 49 ; 5 (3 + 2) min, n = 50 ; 10 (3 + 7) min, n = 59 ; 15 (3 + 12) min, n = 44 ; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROI chacun (tête supérieure, moyenne et inférieure) de 3 à 16 tests indépendants avec des temps d'incubation différents. Données, moyenne ± SEM. Calculs de signification statistique, Kruskal–Wallis/Dunn's. *P < 0,05 ; **P < 0,01. Les valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

La cinétique des zones de la membrane supérieure de la tête de la colonne vertébrale était unique, car elle montrait une augmentation relativement continue des niveaux de PIP2 au cours des phases 1 et 2 (Fig. 4b – d). De plus, la chute des niveaux de PIP2 dans la phase 3 a atteint des niveaux beaucoup plus bas dans la tête moyenne et inférieure par rapport aux données pour le compartiment de la membrane de la tête de la colonne vertébrale supérieure (Fig. 4b – d).

Ces observations suggèrent que la cinétique PIP2 associée à LTD diffère dans les sous-compartiments des têtes de la colonne vertébrale. L'augmentation des zones membranaires supérieures et moyennes de la tête de la colonne vertébrale peut refléter l'importance de PIP2 dans la régulation de la disponibilité des récepteurs AMPA au PSD et/ou l'initiation de changements structurels dans la tête de la colonne vertébrale.

Il a été suggéré que PIP2 est impliqué dans l'ancrage des récepteurs AMPA synaptiques et/ou dans l'endocytose des récepteurs AMPA32. Malheureusement, l'établissement de doubles marquages ​​immunologiques à l'or des récepteurs AMPA et/ou NMDA ainsi que de différents composants endocytaires, tels que la clathrine et la dynamine, ainsi que des protéines d'échafaudage postsynaptiques, telles que les protéines PSD95 et ProSAP/Shank, ainsi que le succès PIP2 la détection a échoué. Conformément à ces difficultés, les récepteurs NMDA et AMPA ont été détectés du côté extracellulaire après la fabrication de la membrane33,34,35,36,37 et les difficultés de détection des protéines, qui sont simplement indirectement ou simplement associées de manière périphérique aux membranes mais non insérées, sont probablement en raison de la procédure de préparation de l'échantillon, qui fournit un accès complet à la membrane en éliminant efficacement ce matériau. Les processus biologiques cellulaires impliquant la signalisation PIP2 reposeraient vraisemblablement sur une sorte de nanodomaines enrichis en PIP2 dans les membranes vertébrales. En effet, nous avons pu observer des clusters PIP2 dans des membranes plasmiques cryoconservées et fracturées par congélation de neurones en culture (Fig. 5a).

a Exemple d'image TEM d'une colonne vertébrale cryoconservée, fracturée par congélation et marquée à l'immunogold anti-PIP2 d'un neurone primaire de l'hippocampe traité avec du NMDA pendant 3 min. Les signaux anti-PIP2 regroupés (n ≥ 3 particules d'or dans une ROI circulaire d'un diamètre de 100 nm) et (plus) dispersés dans la tête de la colonne vertébrale sont respectivement marqués de cercles et d'une pointe de flèche. Barre, 200 nm. b Quantification de la distribution des marqueurs immunogold anti-PIP2 dans les têtes de la colonne vertébrale trouvées dans un cluster par rapport aux marqueurs en dehors de tout cluster (en pourcentage du marquage total trouvé au niveau de la membrane de la tête de la colonne vertébrale). Notez l'augmentation transitoire du regroupement 2 et 3 min dans le traitement NMDA. Données, moyenne ± SEM. 0 min, n = 159 ; 1 min, n = 36 ; 2 min, n = 53 ; 3 min, n = 49 ; 5 (3 + 2) min, n = 50 ; 10 (3 + 7) min, n = 59 ; 15 (3 + 12) min, n = 44 ; 30 (3 + 27) min, n = 35 ROI (tête de la colonne vertébrale) chacune de 3 à 16 tests indépendants avec des temps d'incubation différents. ANOVA bidirectionnelle/test de comparaison multiple de Šídák (comparaisons à 0 min). *P < 0,05 ; ***P < 0,001. Les valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

La fréquence de ces grappes ainsi que la fraction relative de PIP2 en grappes étaient faibles à l'état d'équilibre, mais augmentaient fortement lorsque les neurones étaient stimulés avec du NMDA. Des analyses quantitatives détaillées des têtes de colonne vertébrale ont révélé que seulement 22, 4% de tous les marqueurs anti-PIP2 étaient détectés dans les grappes à l'état d'équilibre (Fig. 5b; 0 min). En revanche, dès 2 min après le début du traitement NMDA, 57, 6% de tous les marqueurs PIP2 ont été trouvés à l'intérieur des grappes (Fig. 5b; 2 min).

De manière frappante, le regroupement de PIP2 semblait principalement être un phénomène de courte durée et précoce de l'augmentation rapide de PIP2 dans les têtes de colonne vertébrale, car l'occurrence statistiquement significative et prédominante de PIP2 à l'intérieur de nanodomaines membranaires de moins de 100 nm de diamètre (la plupart étaient d'environ 50 nm ) a été observé exclusivement 2 min et 3 min après le début de l'induction LTD (Fig. 5b).

Étonnamment, quelques minutes seulement après la fin du traitement NMDA, le PIP2 maintenant fortement élevé dans la tête de la colonne vertébrale (comparer la Fig. 3k) a été distribué de manière principalement dispersée, similaire à la distribution à l'état d'équilibre (Fig. 5b ; comparer une distribution similaire de 0 min contre 3 + 2 min et 3 + 7 min, respectivement). De plus, la dernière phase reflétant la baisse des niveaux de PIP2 après l'induction de LTD (15 et 30 min) n'a montré aucune altération statistiquement significative du regroupement de PIP2 (Fig. 5b).

La deuxième phase de la signalisation PIP2 induite par LTD, qui est marquée par les niveaux les plus élevés de PIP2 dans les têtes de la colonne vertébrale dendritique (Figs. 3, 4), a ainsi montré une distribution complètement différente de PIP2 par rapport à la phase initiale d'induction LTD.

Il a été démontré que l'homologue de la phosphatase et de la tensine supprimé sur le chromosome 10 (PTEN) était recruté dans le PSD après l'induction de la LTD et il a été suggéré que les signaux PIP2 pendant la LTD sont générés par la déphosphorylation de PIP3 (Fig. 6a). Les composés de bisperoxovanadium inhibent les protéines tyrosine phosphatases mais surtout le bpV(HOpic) a montré une sélectivité pour le PTEN à de faibles concentrations38. Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine des accumulations de PIP2 dans les épines dendritiques que nous avons observées dans les différentes phases des signaux PIP2 lors de l'induction de LTD, nous avons donc examiné des neurones incubés avec l'inhibiteur de PTEN bpV(HOpic) pendant 60 min avant l'induction de LTD avec NMDA ( Fig. 6b–j).

un schéma visualisant les itinéraires suggérés vers PIP2 pendant LTD et l'inhibition par bpV (HOpic). b – g Images TEM représentatives d'épines cryo-préservées, fracturées par congélation et marquées à l'immuno-PIP2 de neurones hippocampiques DIV14-16 prétraitées pendant 60 min avec ddH2O comme véhicule témoin (b – d) ou avec 15 nM bpV (HOpic ) (e–g) et soumis à une LTD induite par le NMDA pendant 2 min (c, f) et pendant 3 min de NMDA suivi d'un temps de post-incubation de 7 min (d, g) par rapport aux témoins non traités au NMDA (0 min) (être). Barres, 200 nm. h Analyses quantitatives de la densité de marquage anti-PIP2 dans les neurones prétraités avec bpV(HOpic) par rapport aux neurones simplement traités avec ddH2O (−bpV(HOpic)) dans les mêmes tests ne révélant aucun effet statistiquement significatif de l'inhibition de PTEN sur les niveaux basaux de PIP2 . Les densités de marquage ont été normalisées au contrôle respectif - bpV(HOpic). i, j Analyses quantitatives de la signalisation PIP2 au cours de la première et de la deuxième phase de l'induction de LTD dans la colonne vertébrale totale (i) et dans la tête de la colonne vertébrale (j), respectivement, (toutes deux normalisées aux données respectives de 0 min pour les densités totales de marquage de la colonne vertébrale de chacune des deux conditions, c'est-à-dire avec et sans inhibiteur). Données, moyenne ± SEM. -bpV(HOpic), 0 min, n = 39 ; 2 min, n = 29 ; 10 (3 + 7) min, n = 33 ROI chacun (total des épines ; têtes de la colonne vertébrale) et +bpV(HOpic), 0 min, n = 33 ; 2 min, n = 30 ; 10 (3 + 7) min, n = 27 ROI chacun (total des épines ; têtes de la colonne vertébrale) des neurones primaires de 3 tests indépendants. Mann-Whitney (h); ANOVA bidirectionnelle/comparaison multiple de Bonferroni entre les conditions ±bpV(HOpic) (i, j). *P < 0,05. Des comparaisons multiples supplémentaires de Kruskal-Wallis/Dunn ont été effectuées pour comparer les données + et -bpV(HOpic) à 2 min et à 3 + 7 min à 0 min de données de contrôle (i, j) #P < 0,05 ; ##P < 0,01. Les valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

À l'état d'équilibre (0 min), les traitements avec bpV(HOpic) n'ont pas entraîné de niveaux de PIP2 significativement différents dans les épines dendritiques par rapport au prétraitement avec un solvant témoin (ddH2O ; -bpV(HOpic) (Fig. 6h). les niveaux de la première phase (représentés par un traitement NMDA de 2 min) sont restés totalement insensibles à l'inhibition de PTEN dans les deux zones totales de la membrane plasmique de la colonne vertébrale (Fig. 6i ; 235 % de l'état d'équilibre ; P = 0,0148) et dans les zones de la membrane plasmique de la tête de la colonne vertébrale (Fig. 6j ; 269 % de l'état d'équilibre ; P = 0,0321).

Contrairement à la première phase insensible au bpV(HOpic) de la dynamique PIP2 de l'induction LTD, la deuxième phase de la dynamique PIP2 (représentée par 3 min NMDA + 7 min) s'est avérée être affectée par l'inhibition de PTEN. Alors que la densité de PIP2 dans les membranes vertébrales des neurones non soumis à l'inhibition de PTEN était de 246% des niveaux de PIP2 à l'état d'équilibre et était donc statistiquement significativement différente de la valeur à 0 min (P = 0, 0020) (Fig. 6i), les niveaux de PIP2 dans le la membrane plasmique des épines dendritiques des neurones préincubés avec un inhibiteur de PTEN à 3 + 7 min ressemblait plutôt aux données à 0 min (Fig. 6i).

Les effets inhibiteurs de bpV(HOpic) dans la deuxième phase de la dynamique de PIP2 étaient particulièrement évidents dans les membranes de la tête de la colonne vertébrale. Ici, les niveaux de PIP2 étaient fortement élevés dans les neurones témoins non traités avec un inhibiteur à 3 + 7 min par rapport à 0 min (Fig. 6j; 297%; P = 0, 0131). En revanche, dans les neurones prétraités avec bpV (HOpic), les niveaux de PIP2 à 3 + 7 min n'étaient qu'environ 150% des données à 0 min et étaient donc statistiquement significativement différents des données environ deux fois plus élevées à 3 + 7 min obtenues dans la tête de la colonne vertébrale. zones membranaires des neurones non soumises à l'inhibition de PTEN (Fig. 6j; P = 0, 0259).

Ainsi, alors que la phase initiale des signaux PIP2 dans l'induction de LTD est complètement indépendante des apports de PIP2 par déphosphorylation de PIP3, l'activité enzymatique de PTEN contribue fortement spécifiquement à la deuxième phase de l'accumulation de PIP2 médiée par LTD dans les têtes des épines dendritiques.

Chez les eucaryotes, PIP2 est fréquemment généré par la phosphorylation de PI4P par les phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinases (PI4P5Ks/PIP5Ks) (Fig. 7a). Parmi les différentes isozymes de PIP5K, PIP5Kγ montre une forte expression dans le cerveau39. L'UNC3230 a inhibé sélectivement PIP5Kγ40 dans les neurones du ganglion de la racine dorsale et est le seul inhibiteur de PIP5K disponible dans le commerce. Nous avons donc utilisé UNC3230 pour disséquer davantage la source de PIP2 au cours des différentes phases des signaux PIP2 lors de l'induction LTD (Fig. 7b – g). Le prétraitement des neurones de l'hippocampe pendant 16 h avec 500 nM d'UNC3230 n'a entraîné aucun effet statistiquement significatif sur les niveaux de PIP2 à l'état d'équilibre (t = 0 min) par rapport au témoin de solvant (Fig. 7h).

un schéma visualisant les itinéraires suggérés vers PIP2 pendant la LTD et l'inhibition par l'inhibiteur de PIP5K UNC3230. b – g Images TEM d'épines dendritiques d'épines immunomarquées anti-PIP2, fracturées par congélation de neurones hippocampiques DIV14-16, qui ont été prétraitées avec un véhicule témoin (DMSO à 0,002 %) (−UNC3230, b–d) ou avec 500 nM UNC3230 ( e-g) avant d'induire LTD par 2 min NMDA (50 µM) ou avec 3 min NMDA et 7 min de temps de récupération (3 + 7 min), respectivement, ou de cryoconserver les cellules à l'état d'équilibre (0 min). Barres, 200 nm. h Analyses quantitatives de la densité de marquage anti-PIP2 des neurones + UNC3230 et -UNC3230 à l'état d'équilibre normalisés au contrôle respectif non traité. i, j Analyses quantitatives de la dynamique de PIP2 révélant un très fort impact négatif de l'inhibition de PIP5K sur la première (2 min) et la deuxième (3 + 7 min) phases de signaux PIP2 élevés pendant l'induction LTD. Données, moyenne ± SEM. −UNC3230, 0 min, n = 62 ; 2 min, n = 46 ; 10 (3 + 7) min, n = 35 ROI chacun (total des épines ; têtes d'épine) et + UNC3230, 0 min, n = 50 ; 2 min, n = 40 ; 10 (3 + 7) min, n = 34 ROI chacun (total des épines ; têtes de la colonne vertébrale) des neurones primaires de 3 tests indépendants. Mann–Whitney (h; ns); ANOVA bidirectionnelle/comparaison multiple de Bonferroni entre les conditions ±UNC3230 (i, j) *P < 0,05 ; **P < 0,01. Comparaison multiple supplémentaire de Kruskal-Wallis/Dunn pour la comparaison des données +UNC3230 et -UNC3230 à 2 min et 3 + 7 min à 0 min données de contrôle (i, j)#.P < 0,05 ; ##P < 0,01. Les valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

En revanche, l'inhibition de PIP5Kγ a entraîné un blocage complet de l'augmentation de PIP2 pendant la première (2 min) et la deuxième phase (3 + 7 min) de la dynamique de PIP2 pendant l'induction de LTD. Ce blocage efficace de l'accumulation de PIP2 induite par LTD au cours des deux phases a été souligné par des différences claires et statistiquement significatives entre les conditions + et -UNC3230. L'altération complète de la dynamique PIP2 induite par LTD dans les épines dendritiques était évidente, que la colonne vertébrale totale (Fig. 7i) ou exclusivement les zones membranaires de la tête de la colonne vertébrale aient été examinées (Fig. 7j). Dans toutes les conditions + UNC3230, les niveaux de PIP2 sont restés égaux à l'état d'équilibre (0 min) (Fig. 7i, j).

Ainsi, PIP5Kγ est clairement essentiel dans la génération de PIP2 lors de l'induction LTD induite par NMDA et, contrairement à la contribution sélective de phase 2 de PTEN, PIP5Kγ est absolument critique pendant les deux phases initiales des signaux PIP2 lors de l'induction LTD identifiée dans nos analyses quantitatives.

Afin de comprendre la dynamique de PIP2 induite par LTD dans les épines dendritiques, il était ensuite important d'étudier les mécanismes moléculaires entraînant l'élimination efficace de PIP2 des zones de membrane plasmique de la colonne vertébrale dendritique dans la phase trois de la dynamique de PIP2 lors de l'induction de LTD. Outre la diffusion de PIP2 à partir des zones de la tête de la colonne vertébrale, plusieurs enzymes catalysent les réactions convertissant PIP2. Plus important encore, la phospholipase C (PLC) clive PIP2 en diacylglycérine (DAG) et inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) (Fig. 8a). Nous avons donc traité les neurones primaires de l'hippocampe avec l'inhibiteur de PLC U-7312241 par rapport au solvant témoin (diméthylsulfoxyde (DMSO)) et examiné les niveaux de PIP2 avec et sans induction de LTD (Fig. 8b – j). U-73122 n'a entraîné aucune altération des densités de marquage PIP2 avant l'induction LTD (Fig. 8h) ni n'a modifié l'augmentation rapide des niveaux de PIP2 pendant les phases initiales de l'induction LTD, même après 10 min (3 + 7 min ) Les niveaux de PIP2 sont restés similaires à ceux des épines dendritiques et des têtes d'épines dendritiques non traitées avec l'inhibiteur, respectivement (Fig. 8i, j).

un schéma visualisant la dégradation de PIP2 donnant DAG + IP3 et l'inhibition par l'inhibiteur de PLC U-73122. b – g Images TEM d'épines dendritiques d'épines immunomarquées anti-PIP2, fracturées par congélation de neurones hippocampiques DIV14-16, qui ont simplement été prétraitées avec un véhicule témoin (0, 2% DMSO) (-U-73122, b – d) ou avec 10 µM U-73122 (e–g) avant d'induire la LTD par 3 min NMDA et 7 min de temps de récupération (3 + 7 min) et par 3 min NMDA et 27 min de temps de récupération (3 + 27 min), respectivement, ou de quitter les cellules à l'état d'équilibre (0 min). Barres, 200 nm. h Analyses quantitatives de la densité de marquage anti-PIP2 des neurones + U-72122 et -U-73122 à l'état d'équilibre normalisés au contrôle respectif non traité. (i, j) Analyses quantitatives de la dynamique de PIP2 démontrant que l'inhibition de la PLC n'a aucun effet sur les niveaux de PIP2 pendant la deuxième phase (3 + 7 min) de l'induction de LTD mais bloque complètement la restauration des niveaux de PIP2 à l'état d'équilibre pendant la troisième phase (3 + 27 min) de la dynamique PIP2 lors de l'induction LTD. Données, moyenne ± SEM. -U-73122, 0 min, n = 28 ; 3 + 7 min, n = 27 ; 3 + 27 min, n = 32 ROI chacun (total des épines ; têtes de la colonne vertébrale) et +U-73122, 0 min, n = 27 ; 3 + 7 min, n = 25 ; 3 + 27 min, n = 26 ROI chacun (total des épines ; têtes de la colonne vertébrale) des neurones primaires de 3 tests indépendants. Mann–Whitney (h; ns); ANOVA bidirectionnelle/comparaison multiple de Bonferroni entre les conditions ±U-73122 (i, j). *P < 0,05 ; **P < 0,01. Tests de Mann – Whitney supplémentaires pour les comparaisons des données + U-73122 et -U-73122 à 3 + 7 min et 3 + 27 min aux données de contrôle de 0 min (i, j). #P < 0,05 ; ##P < 0,01 ; ###P < 0,001. Les valeurs P sont rapportées directement dans la figure. Pour les données de source numériques, voir les données supplémentaires 1.

En revanche, la troisième phase de la signalisation PIP2 lors de l'induction LTD s'est avérée complètement dépendante de l'activité PLC. Alors qu'après 30 min, les zones de membrane plasmique de la colonne vertébrale dendritique de contrôle et les zones de membrane de la tête de la colonne vertébrale de contrôle affichaient une inversion complète de l'augmentation transitoire de PIP2 induite par LTD, l'inhibition de la PLC avec l'U-73122 a complètement bloqué cette baisse. À 30 min, les densités de marquage anti-PIP2 dans les zones de membrane plasmique totale de la colonne vertébrale ainsi que dans les zones de membrane de la tête de la colonne vertébrale persistaient à des niveaux très élevés (Fig. 8i, j).

Ces résultats ont clairement dévoilé que les signaux PIP2 induits par LTD dans la membrane de la tête de la colonne vertébrale dendritique sont activement interrompus par la dégradation de PIP2 par PLC. Au total, nos données dévoilent ainsi une augmentation transitoire des signaux PIP2 dans la membrane plasmique des épines dendritiques, mettent en évidence la cinétique de ces signaux et dévoilent les mécanismes moléculaires qui jouent un rôle crucial dans la dynamique des signaux PIP2 induits par LTD dans les zones membranaires de la tête de la colonne vertébrale.

Les signaux de signalisation émanant des phosphoinositides sont considérés comme des aspects clés pour une variété de fonctions cellulaires, mais ces signaux temporels et spatiaux sont très difficiles à visualiser et à étudier dans les membranes cellulaires. Ici, nous décrivons la première immunodétection à ultra haute résolution à notre connaissance de PIP2. Nos analyses fournissent les informations spatiales et temporelles quantitatives sur PIP2 dans la membrane plasmique du compartiment postsynaptique des cellules neuronales nécessaires pour suivre les signaux PIP2 dans la plasticité synaptique. Étonnamment, par rapport aux niveaux de PIP2 trouvés dans les zones de membrane plasmique du soma des neurones, qui étaient conformes aux détections abondantes de PIP2 utilisant des protéines de fusion GST purifiées du domaine PH de PLC dans des cellules non neuronales21,42,43, le PIP2 les concentrations dans la membrane plasmique de l'arbre dendritique étaient généralement très faibles. Dans le compartiment dendritique, PIP2 semble donc agir comme un véritable signal de signalisation.

En utilisant la microscopie optique et le domaine PH d'extinction de PIP2 de PLC comme sonde protéique, Horne et Dell'Acqua16 ont suggéré que PIP2 est fortement enrichi en épines dendritiques par rapport aux dendrites. Nos déterminations quantitatives ont montré qu'en utilisant des méthodes de cryofracturation, cet enrichissement en PIP2 dans les épines dendritiques à l'état d'équilibre est en fait faible. Nos examens au microscope électronique ont révélé qu'exclusivement les membranes de la tête de la colonne vertébrale présentaient un fort enrichissement (environ + 40 %) par rapport aux niveaux généraux de dendrites.

Bien que des méthodes de super-résolution aient été appliquées pour la détection de PIP2 dans les cellules PC12, la microscopie optique est d'une utilité limitée pour les corrélations détaillées avec les sous-structures des épines dendritiques dans les cellules neuronales, car ces sous-structures sont très petites. Il est important de noter que l'expression exogène de protéines rapporteurs, telles que PLC-PH, bien qu'étant largement utilisée comme sonde PIP2, ne signale pas non plus sans ambiguïté les changements de niveau de PIP2 car il a été démontré que PLC-PH est déplacé de PIP2 par l'augmentation du produit de dégradation intracellulaire de PIP2. IP36,46. Cette limitation est sévère, car la demi-vie de PIP2 dans les cellules n'est que d'environ 1 min47,48. L'expression de PLC-PH a en outre un impact sur la physiologie et la signalisation cellulaires en entrant en compétition avec l'enzyme PLC dégradant PIP2 et en éteignant les signaux PIP2, car PLC-PH lié à PIP2 entrera en compétition avec la liaison des protéines effectrices PIP2, telles que les protéines endocytaires, cytosquelettiques et composants de signalisation7 et entravent ainsi la reconnaissance et la transmission correctes des signaux PIP2. Il est important de noter que les procédures de fixation chimique sont également susceptibles d'interférer avec la distribution physiologique des signaux lipidiques50,51. La combinaison de la cryoconservation très rapide, de la congélation-fracturation, de la stabilisation irréversible des composants membranaires par évaporation du carbone et du platine, du marquage immunogold de la réplique de la membrane et de l'examen TEM surmonte toutes ces anciennes limitations et offre une vision claire des signaux PIP2 pendant LTD.

Nos évaluations quantitatives des niveaux, de la distribution et de l'organisation relatifs de PIP2 et les différentes études sur les inhibiteurs révèlent que la signalisation de PIP2 pendant la LTD se produit selon un schéma défini. Tout d'abord, une augmentation rapide des niveaux de PIP2 a été observée dans les 2 premières minutes d'induction de LTD par application de NMDA. Dans les zones membranaires des têtes vertébrales, cette première augmentation a atteint près de 250 % des niveaux de PIP2 à l'état d'équilibre. Un rôle de PIP2 dans l'induction de LTD est conforme à la découverte que la dimérisation induite chimiquement pour déplacer l'enzyme de dégradation de PIP2 inositol polyphosphate 5-phosphatase vers la membrane plasmique et épuiser ainsi PIP2 au niveau de la membrane plasmique a conduit à une perturbation de l'induction de LTD par stimulation à basse fréquence19. L'augmentation observée de PIP2 au cours de l'induction précoce de LTD que nous avons déterminée contraste fortement avec les observations d'une baisse de la concentration de PIP2 dans les épines dendritiques 1 minute après la stimulation NMDA16. Les données contradictoires respectives, cependant, ont été obtenues en utilisant la microscopie à fluorescence et la surexpression de PLC-PH étiqueté GFP et ont donc été affectées par toutes les limitations techniques et scientifiques déjà discutées ci-dessus. La forte augmentation des niveaux de PIP2 dans la membrane plasmique des épines dendritiques que nous avons observée dans nos études à ultra haute résolution sur les membranes fracturées par congélation était spécifiquement localisée dans les zones de la membrane plasmique de la tête de la colonne vertébrale. Cette augmentation rapide de PIP2 dans la tête de la colonne vertébrale est conforme au rôle de PIP2 dans l'induction de la LTD, car on pense que la LTD implique principalement des réorganisations du cytosquelette des récepteurs et de l'actine dans les têtes de la colonne vertébrale1,2,3,4.

De manière frappante, les premières minutes des signaux PIP2 pendant LTD étaient également la seule fois avec un regroupement statistiquement significatif de PIP2. Des clusters PIP2 ont été observés dans l'endocytose médiée par la clathrine32. PIP2 se lie à diverses protéines impliquées dans l'endocytose et est essentielle pour initier et maintenir l'assemblage des fosses revêtues d'endocytose52,53,54,55,56,57,58,59. Le regroupement de PIP2 au niveau des sites endocytaires naissants peut recruter et augmenter la concentration locale de protéines, telles que les protéines contenant des domaines epsin et BAR, qui à leur tour contribuent à la déformation de la membrane et à la formation de vésicules endocytaires60,61.

L'induction de la LTD médiée par le NMDA est marquée par l'endocytose des récepteurs AMPA dans les premières minutes après la stimulation31, 62, 63 et on pense que cette internalisation se produit préférentiellement dans les zones périsynaptiques63. Ces observations sont conformes à la fois à la période des signaux PIP2 dans les épines dendritiques que nous avons déterminées et à l'accumulation et à la persévérance de niveaux PIP2 fortement élevés spécifiquement dans les zones de membrane plasmique supérieure et moyenne des têtes d'épines dendritiques après l'induction LTD observée dans notre plus analyses détaillées des sous-domaines de la membrane vertébrale.

Nos études sur les inhibiteurs ont indiqué que l'augmentation rapide de PIP2 lors de l'induction initiale de LTD est presque exclusivement générée par PI4P. Dans cette optique, on pense que PIP5Kγ est principalement responsable de la synthèse de PIP2 au niveau des synapses64. Fait intéressant, PIP5Kγ661 déphosphorylé s'associe au complexe adaptateur endocytaire AP265, 66 et les neurones exprimant un mutant PIP5Kγ661 mort par kinase ou un mutant incapable de s'associer au complexe AP2 n'ont pas présenté de LTD après LFS20.

La deuxième phase des signaux PIP2 dans les épines dendritiques pendant l'induction LTD a été marquée par une augmentation supplémentaire mais moins rapide des niveaux de PIP2, qui était limitée spécifiquement aux zones de membrane plasmique supérieure et moyenne de la tête de la colonne vertébrale. Encore une fois, l'inhibition de PIP5K par UNC3230 a abrogé cette période de temps de la dynamique PIP2. De plus, la génération de PIP2 à partir de PIP3 a contribué aux niveaux élevés de PIP2 de cette phase, comme en témoigne l'inhibition de PTEN à l'aide de bpV(HOpic). Cette découverte est conforme aux observations selon lesquelles le PTEN s'est accumulé au PSD après l'incubation du NMDA et l'inhibition du PTEN par le bpV (HOpic) a aboli le LTD dans les neurones de l'hippocampe17. En revanche, la première phase de la dynamique de PIP2 était insensible à l'inhibition de PTEN. Ces résultats mettent clairement en évidence la nature biphasique de l'augmentation des niveaux de PIP2 observée dans les têtes de la colonne vertébrale dendritique lors de l'induction de LTD.

Les événements de signalisation temporels nécessitent une fin en temps opportun. C'est l'aspect majeur de la troisième phase de la dynamique PIP2 commençant environ 10 min après l'induction LTD induite par le NMDA. Les niveaux de PIP2 à l'état d'équilibre dans les épines dendritiques étaient observables après environ 30 min. Il est important de noter que, contrairement à l'utilisation de PLC-PH surexprimé comme sonde PIP2, la détection directe à base d'anticorps de PIP2 que nous avons appliquée pour nos analyses n'est pas affectée par la dissociation de PIP2 due à l'augmentation de IP3. La baisse observée de la densité de marquage reflète donc bien une baisse de PIP2 dans la membrane plasmique des épines dendritiques. Alors que les tendances des niveaux de PIP2 légèrement élevés dans les zones de membrane plasmique de la base de la colonne vertébrale et de la dendrite environnante peuvent suggérer une certaine contribution de la diffusion de PIP2 hors des zones de membrane de la tête de la colonne vertébrale enrichies en PIP2, le déclin observé a clairement été provoqué par une dégradation active de Signaux PIP2 par PLC, comme démontré par l'inhibition PLC avec U-73122. Conformément à une certaine importance de PLC dans LTD, l'application de U-73122 a été décrite comme altérant LTD67.

Il semble concevable que la réduction observée des niveaux de PIP2 à des stades ultérieurs soit liée à des modifications du cytosquelette d'actine, qui conduisent finalement au rétrécissement des têtes de la colonne vertébrale dendritique observées lors de LTD. PIP2 peut s'opposer aux réorganisations d'actine requises et stabiliser les filaments d'actine car il inhibe par exemple l'activité de séparation de l'actine F de la cofiline68 et de la gelsoline69. PIP2 peut en outre s'opposer au rétrécissement de la colonne vertébrale en reliant le cytosquelette d'actine à la membrane plasmique70,71,72,73. Notre observation selon laquelle des niveaux transitoirement élevés de PIP2 ont atteint des niveaux d'équilibre dans les membranes dendritiques de la tête de la colonne vertébrale 30 min après l'induction de la LTD est temporellement très conforme à l'observation selon laquelle, suite à des stimulations à basse fréquence de tranches d'hippocampe, des réductions du volume et du diamètre de la tête de la colonne vertébrale pourraient être observée 15 à 60 min après la stimulation74.

Au total, cette étude fournit des vues à ultra-haute résolution de PIP2 pendant l'induction LTD et dévoile les principes spatiaux et temporels et les mécanismes moléculaires sous-jacents aux signaux PIP2 et leur terminaison en temps opportun pendant l'induction LTD dans les sous-domaines de la membrane dendritique de la colonne vertébrale.

Les liposomes ont été essentiellement préparés selon Reeves et Dowben75. En détail, des mélanges de lipides dans du chloroforme et du méthanol (98:2 (v/v)) ont été étalés en couche mince au fond d'un flacon de Fernbach. Les mélanges consistaient en 65 % (p/v) de phosphatidyléthanolamine (PE), 30 % (p/v) de phosphatidylcholine (PC) et 5 % (p/v) de PIP2, PIP3, PI(3,4)P2 et PS, respectivement. . Les lipides ont été séchés sous un flux constant d'azote gazeux pendant 30 à 60 min et tous les solvants restants ont été éliminés par une incubation de 1 h dans un dessiccateur. Ensuite, les lipides ont été réhydratés avec un flux d'azote saturé d'eau pendant 30 à 60 min avant d'ajouter 5 ml de saccharose 0,3 M dans ddH2O pour permettre une hydratation et un détachement supplémentaires des liposomes du flacon pendant 14 h à 37 ° C. La suspension contenant les liposomes a ensuite été centrifugée à 200 000 × g pendant 1 h à 28 °C. Le culot contenant les liposomes a été remis en suspension dans 20 ul de saccharose 0,3 M dans ddH20 avec une concentration finale en lipides de 8 mg/ml.

Les rats (Crl:WI ; Charles River) utilisés pour obtenir du matériel biologique ont été élevés par l'animalerie de l'hôpital universitaire d'Iéna dans le strict respect des directives de l'UE pour les expérimentations animales (approuvées par le Thüringer Landesamt, Bad Langensalza ; Allemagne). Comme exclusivement des cellules primaires ont été préparées à partir de rats gravides post-mortem, aucune autorisation d'expérimentation animale n'était requise pour cette étude. Les embryons utilisés pour les préparations de neurones hippocampiques primaires étaient E18 et de sexe mixte (indéterminé).

Les cellules NIH3T3 ont été maintenues et cultivées dans des conditions standard.

Des neurones hippocampiques primaires de rat (Crl:WI; Charles River) ont été préparés et cultivés en grande partie selon les principes développés par Banker et Cowan76 et établis précédemment23. En détail, des cerveaux de rats E18 ont été disséqués dans du HBSS glacé (Invitrogen). Les hippocampes isolés ont ensuite été trypsinés avec 0,05 % de trypsine/EDTA (Invitrogen) pendant 15 min à 37 °C. Le surnageant a été remplacé par du milieu Neurobasal (Invitrogen) et additionné de supplément B-27 (Invitrogen) et de L-glutamate 0,5 mM. Le tissu a ensuite été dissocié en cellules individuelles par trituation soigneuse avec une pipette Pasteur de 1 ml.

En guise de préparation à la congélation-fracturation, les neurones devaient être cultivés dans des plaques à 24 puits avec des disques de saphir (Rudolf Brügger, Swiss Micro Technology)22,23. En guise de préparation, des disques de saphir ont été soigneusement nettoyés et lavés, puis recouverts de poly-D-lysine pendant une nuit à 37 °C. La poly-D-lysine a été aspirée et soigneusement éliminée en lavant trois fois pendant 10 min avec ddH2O. Les disques de saphir ont ensuite été séchés et irradiés avec de la lumière ultraviolette pendant 15 min.

Les neurones primaires ont été ensemencés à une densité de 80 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits complétée par les disques de saphir préparés. Les neurones hippocampiques primaires ont ensuite été cultivés dans du milieu NeurobasalTM contenant 2 mM de L-glutamine, 1 × B27 et pénicilline/streptomycine (100 U et 100 µg, respectivement, par ml) pendant environ 2 semaines (à 37 °C, 90 % d'humidité et 5 % de CO2). A DIV14-16 sur saphir, les neurones avaient formé des synapses et des réseaux neuronaux22 et ont ensuite été utilisés pour les expériences.

LTD a été induite avec NMDA26,31. En détail, les neurones de l'hippocampe ont été réduits au silence présynaptique par une préincubation avec 2 µM de TTX (60 min) avant d'induire LTD avec 50 µM de NMDA jusqu'à 3 min, suivi d'une chasse dans un milieu préconditionné pour des moments d'analyse distincts.

Pour étudier les voies fournissant de manière transitoire PIP2 pendant l'induction de LTD et conduisant à une baisse des niveaux de PIP2 à des moments ultérieurs, des inhibiteurs ou leur solvant de contrôle correspondant ont été ajoutés avant le traitement NMDA. Les concentrations finales et les temps de préincubation étaient les suivants : bpV(HOpic), 15 nM dans ddH2O pendant 60 min ; U-73122, 10 µM pendant 60 min dans du DMSO à 0,2 % (v/v); UNC3230 à 500 nM pendant 16 h dans du DMSO à 0,002 % (v/v).

Des profilés en cuivre (0,6 mm de hauteur) ont été utilisés pour la cryofracturation. Avant leur utilisation, les profils ont été nettoyés dans un bain de sonication avec 4% (p/v) d'acide tartrique, lavés dans de l'acétone pure puis stockés dans du méthanol pur.

Pour la congélation-fracturation des liposomes, 2 µl de la solution de liposomes ont été répartis entre deux profils en cuivre en utilisant la technique de la double réplique en sandwich77. Le sandwich a été immédiatement surgelé par plongée dans du propane/éthane liquide (1:1) refroidi dans de l'azote liquide (vitesse de refroidissement >4000 K/s)78.

Trois sandwichs ont été placés dans une table à échantillons à double réplique également refroidie dans de l'azote liquide. Les échantillons ont ensuite été transférés dans un appareil de cryofracture BAF400T (Leica) refroidi à -140 °C. Une fois le vide établi et la pression ne dépassant pas 10-6 mbar, la table a été ouverte de manière à ce que les deux profils pris en sandwich avec l'échantillon entre eux se séparent et fracturent l'échantillon. Immédiatement, une couche de carbone de 15 à 20 nm a été évaporée sur les échantillons à un angle de 90°, suivie d'une couche de platine/carbone d'environ 2 nm à un angle de 35°78. Les échantillons ont été extraits de la machine de congélation-fracture, décongelés, flottés sur du SDS à 2,5 % (p/v) et incubés sous agitation douce pendant une nuit à température ambiante.

Après trois lavages de 10 min dans du PBS, toute liaison non spécifique a été bloquée par incubation dans du BSA à 1 % (p/v), de la gélatine de poisson à 0,5 % (p/v), du Tween® 20 à 0,005 % (v/v) dans du PBS (pH 7.2) (LBB) pendant 30 min à TA. La réplique a ensuite été incubée pendant une nuit à 4 °C avec des anticorps anti-PIP2 monoclonaux de souris (Enzo Life Sciences) dans du LBB (condition standard, 1:100, c'est-à-dire 10 µg/ml). L'anticorps primaire non lié a été éliminé en lavant trois fois avec du LBB (10 min chacun). Les échantillons ont ensuite été incubés pendant 2 h dans des anticorps secondaires anti-souris de chèvre liés à des particules d'or dilués dans du LBB (à température ambiante) (5, 10 et 15 nm d'or; Solutions BBI). L'anticorps secondaire non lié a été éliminé par lavage (3 × 10 min) avec du PBS. Les répliques immunomarquées ont ensuite été fixées avec du glutaraldéhyde à 0,5 % (v/v) dans du PBS pendant 10 min, lavées deux fois pendant 10 min avec ddH2O, montées sur des grilles de cuivre non revêtues et séchées.

Pour la congélation-fracturation des cellules NIH3T377,78, une suspension des cellules a été placée entre deux profils de cuivre similaires à ceux décrits ci-dessus pour les analyses de liposomes, puis fracturées par congélation et immunomarquées comme décrit ci-dessus.

Pour les expériences de fracture par congélation neuronale22,23,24, les neurones ont été cultivés sur des disques de saphir recouverts de poly-D-lysine (voir ci-dessus). Les disques de saphir ont été placés sur des profils en cuivre de 0,8 mm de haut pour s'adapter à la table d'échantillons à double réplique. Une gouttelette de 20 % (p/v) de BSA a été ajoutée entre les parties du sandwich pour éviter les artefacts de congélation. La fracture par congélation et l'immunomarquage ont ensuite été effectués comme décrit ci-dessus.

Les répliques ont été examinées avec un microscope électronique à transmission EM902A (Zeiss) fonctionnant à 80 keV.

L'imagerie a été réalisée à l'aide d'une caméra CCD FastScan 1k (caméra TVIPS et logiciel). Les images ont été numérisées avec le logiciel EM-Menu 4 (TVIPS)22,23,24.

La détectabilité de PIP2 dans les membranes par des anticorps anti-PIP2 a d'abord été abordée en utilisant des liposomes contenant PIP2. Les liposomes contenant PIP3, PI(3,4)P2 et PS, respectivement, au lieu de PIP2 ont été examinés comme témoins. Les images ont été prises par échantillonnage aléatoire, c'est-à-dire indépendamment de l'étiquetage PIP2 et incluant des profils nuls. Il en va de même pour l'imagerie des membranes cellulaires NIH3T3.

Des déterminations de spécificité d'immunomarquage anti-PIP2 avec des membranes de neurones fracturées par congélation ont été effectuées avec des neurones hippocampiques de rat à DIV14-16 et un échantillonnage systématique sur les grilles. Les zones des trois catégories (glace et face E comme témoins par rapport à la face P) ont été mesurées, la quantité de particules d'or par zone a été comptée et les densités de marquage (déterminées en particules par µm2) ont été comparées pour tester la spécificité des anticorps.

Des contrôles d'anticorps secondaires et des échantillons fracturés par congélation, pour lesquels la liaison d'anticorps primaire a été désactivée par préincubation de l'anticorps avec des liposomes avec PIP2 ajouté, ont servi de contrôles supplémentaires.

Des expériences quantitatives supplémentaires avec différentes dilutions d'anticorps anti-PIP2 (1:200, 1:100, 1:50 correspondant à des concentrations de 5, 10 et 20 µg/ml) ont été utilisées pour établir une dilution d'anticorps donnant une détection PIP2 saturée.

Avant la visualisation par TEM, les échantillons ont été aveuglés par un collègue. L'aveuglement des images enregistrées a été effectué à l'aide du logiciel Ant Renamer (antp.be/software/renamer). Les images TEM ont été obtenues par criblage systématique des grilles.

Des images de zones de membrane plasmique fracturées par congélation du soma cellulaire et de l'arbre dendritique ont été enregistrées par enregistrement systématique, les images ont été masquées (voir ci-dessus), les zones respectives (E-face, P-face, glace) ont été déterminées et l'anti -La densité de marquage PIP2 a été déterminée. Toutes les structures morphologiques pouvant être clairement classées comme épines de champignons ainsi que les segments de dendrites voisins non décorés d'épines ont été utilisés pour l'analyse, c'est-à-dire que seules les images avec des épines dendritiques inférieures à 0,75 µm et supérieures à 2 µm de longueur et des images d'épines sans toute attache dendritique visible a été rejetée.

Les épines ont été subdivisées en base, cou et tête de la colonne vertébrale. Pour certaines analyses, la tête de la colonne vertébrale a été décomposée en trois parties en divisant la longueur de la tête en trois parties égales en hauteur, ce qui a donné une tête supérieure, moyenne et inférieure. La procédure pour les définitions de zone était la suivante : Tout d'abord, la base a été définie. Une ligne de masse a été tracée reliant les points de la membrane dendritique adjacents à la colonne vertébrale. Deux autres lignes parallèles de longueur égale flanquant la ligne de masse ont été tracées à des distances de 150 nm puis connectées (angles de 90°). Les zones cellulaires incluses ont été définies comme surface de base (voir également Fig. 2). À partir d'une position représentant la moitié de la ligne au sol, une autre ligne a été tracée jusqu'à la pointe de la colonne vertébrale pour définir son axe longitudinal. Rectangulaire à partir de l'axe longitudinal de la colonne vertébrale, une ligne a été tracée à un angle de 90° pour séparer le cou de la région de la tête (Fig. 2). Cette bordure était généralement facilement reconnaissable par l'élargissement 2D du col et par les informations 3D fournies par l'ombrage platine (Fig. 2). La zone de la tête a ensuite été divisée en trois zones (tête inférieure, tête moyenne et tête supérieure) par deux lignes rectangulaires à l'axe longitudinal tracées à des positions reflétant un tiers et deux tiers de la longueur de la tête définie par l'axe longitudinal (Fig. 4a) . Toutes les zones ont ensuite été entourées à l'aide de l'outil de sélection de polygones dans ImageJ/FIJI en suivant les lignes de bordure prédéfinies et le profil de la membrane, respectivement, et mesurées à l'aide d'ImageJ.

Les marqueurs immunogold anti-PIP2 à l'intérieur de chaque zone ont été comptés et la densité de marquage pour chaque subdivision et pour une zone de membrane dendritique supplémentaire correspondant à la colonne vertébrale analysée a été déterminée à l'aide d'ImageJ/FIJI. Dans le cas où les étiquettes étaient positionnées directement sur la bordure dessinée ou les lignes de séparation, elles étaient affectées à la zone couverte par la particule d'or dans une plus large mesure. Toutes les données obtenues, y compris les valeurs élevées et les profils nuls, ont été prises en compte. Aucune analyse de « valeur aberrante » n'a été effectuée et aucune « valeur aberrante » n'a été retirée des collections de données, car la variance biologique est reflétée par la gamme complète des densités de marquage déterminées.

Pour les analyses résolues dans le temps des signaux PIP2 dans les épines et les études d'inhibiteurs, tous les résultats ont été normalisés à la densité de marquage moyenne détectée dans l'ensemble de la colonne vertébrale de l'état d'équilibre (0 min).

Des analyses de cluster ont été menées en utilisant des ROI circulaires d'un diamètre de 100 nm. Selon les procédures établies précédemment22,23,24,77 les clusters ont été définis comme n ≥ 3 particules d'or par ROI.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism. Si, à l'aide du test de Shapiro-Wilk, les données étaient normalement distribuées, un test t de Student (comparaisons de deux conditions) ou une analyse de variance à une voie (ANOVA à une voie) avec un test de comparaisons multiples de Tukey ( comparaison de plus de deux conditions) a été effectuée.

Si le test de Shapiro-Wilk suggérait une distribution non normale, un test de Mann-Whitney (pour 2 conditions) ou un test de Kruskal-Wallis (≥ 3 conditions) avec un test de comparaison multiple de Dunn ultérieur a été utilisé.

Pour les analyses à deux facteurs, une ANOVA à deux facteurs a été menée en combinaison avec les tests de comparaisons multiples de Šídák ou de Bonferroni.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les auteurs déclarent que toutes les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires. Pour les données sources rapportant tous les points de données individuels sous-jacents aux analyses quantitatives, veuillez consulter les données supplémentaires 1.

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Nous remercions K. Gluth, A. Kreusch, S. Linde et M. Roeder pour leur support technique. Ce travail a été soutenu par l'IZKF et par la DFG (RTG1715 SP19 et KE685/7-1 à MMK et QU116/9-1 à BQ).

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Institut de biochimie I, Hôpital universitaire d'Iéna - Université Friedrich Schiller d'Iéna, 07743, Iéna, Allemagne

Sarah A. Hofbrucker-MacKenzie, Eric Seemann, Britta Qualmann et Michael M. Kessels

Centre de microscopie électronique, Hôpital universitaire d'Iéna — Université Friedrich Schiller d'Iéna, 07743, Iéna, Allemagne

Martin Westerman

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SAH-M. et ES a conçu et réalisé des expériences et interprété les données. SAH-M. co-écrit des parties du manuscrit. MW a fourni des conseils techniques et un accès aux techniques et équipements de microscopie électronique. SAH-M., ES et MMK ont visualisé les données. MMK a effectué des examens de confirmation indépendants exigés. BQ et MMK ont conçu le projet, conçu des expériences, interprété les données et rédigé le manuscrit.

Correspondance à Britta Qualmann ou Michael M. Kessels.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Zachary T. Graber et Yugo Fukazawa pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur principal de la manipulation : Joao Valente. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Hofbrucker-MacKenzie, SA, Seemann, E., Westermann, M. et al. La dépression à long terme dans les neurones implique une dynamique temporelle et ultra-structurelle du phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate reposant sur PIP5K, PTEN et PLC. Commun Biol 6, 366 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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Reçu : 21 juin 2022

Accepté : 17 mars 2023

Publié: 03 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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