Stress

Apr 29, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 602 (2023) Citer cet article

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La réponse au stress intégrée (ISR) joue un rôle central dans la réponse au stress cellulaire, principalement par l'arrêt global de la traduction et la régulation à la hausse des molécules liées à l'adaptation cellulaire. Le facteur de différenciation de croissance 15 (Gdf15) est un puissant biomarqueur sensible au stress de la détresse inflammatoire et métabolique clinique dans divers types de maladies. Ici, nous évaluons si le stress cellulaire induit par l'ISR contribue aux résultats physiopathologiques en modulant Gdf15. L'analyse du transcriptome clinique démontre que la PKR est positivement associée à l'expression de Gdf15 chez les patients atteints de lésions rénales. L'expression de Gdf15 dépend de l'ISR liée à la protéine kinase R (PKR) pendant la détresse réno-intestinale aiguë chez la souris et l'ablation génétique de Gdf15 aggrave les lésions induites par les produits chimiques dans les tissus rénaux et la barrière intestinale. Une évaluation approfondie du microbiote intestinal indique que Gdf15 est associé à l'abondance de bactéries liées au métabolisme de la mucine et de leurs enzymes. De plus, Gdf15, sensible au stress, facilite la production de mucine et la survie cellulaire via la réorganisation du réseau de régulation de l'autophagie. Collectivement, le Gdf15 activé par l'ISR contrecarre les processus pathologiques via la reprogrammation protectrice du réseau autophagique et de la communauté microbienne, fournissant ainsi des biomarqueurs prédictifs robustes et des interventions contre la détresse réno-intestinale.

La détresse réno-intestinale est une conséquence pathologique d'une communication interorganique préjudiciable entre l'intestin et les reins. De nombreuses preuves suggèrent que le tractus gastro-intestinal est une source majeure de microbes et de cellules liées au système immunitaire, entraînant des insultes inflammatoires chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (IRA) ou d'insuffisance rénale chronique (IRC)1,2,3. De même, des manifestations rénales, y compris des lésions tubulaires rénales, une néphrolithiase, une néphrite tubulo-interstitielle, une glomérulonéphrite et une amylose, ont été signalées chez 4 à 23 % des patients souffrant de troubles de la barrière intestinale, comme une maladie inflammatoire de l'intestin4,5,6. Expérimentalement, il a été démontré qu'une MRC avancée peut déclencher des lésions de la barrière muqueuse intestinale et une inflammation systémique subséquente, aggravant ainsi la gravité de la maladie3. En particulier, les niveaux de bactériémie ou d'endotoxémie sont fortement associés à la gravité de la maladie chez les patients atteints d'IRC7,8. Les facteurs indésirables d'origine intestinale, notamment le microbiote nuisible, les endotoxines et les toxines urémiques, contribuent aux lésions rénales9. Un autre modèle clinique représentatif de détresse réno-intestinale est une complication induite par la chimiothérapie10,11, bien que les agents chimiothérapeutiques à base de platine, tels que le cisplatine (CP), soient largement utilisés pour traiter les tumeurs solides et les hémopathies malignes12. Selon une enquête de cohorte de 6 ans, environ 34 % des patients adultes atteints de divers types de cancer ayant reçu une chimiothérapie CP ont présenté une IRA, la plupart des patients présentant des résultats rénaux à long terme tels qu'une baisse légère mais permanente de la filtration glomérulaire estimée. (DFGe)13. En plus des lésions rénales, la chimiothérapie a été associée à l'induction de mucosite14. Malgré les effets bénéfiques des agents anticancéreux, 20 à 40 % des patients atteints de tumeurs solides développeraient une mucosite après un traitement anticancéreux15. Les cellules ou les tissus à croissance rapide, tels que les muqueuses de la bouche, de l'estomac et des intestins, sont les principales cibles des actions néfastes médiées par les médicaments anticancéreux via des facteurs de stress génotoxiques16.

Le facteur de différenciation de croissance 15 (Gdf15) est un membre de la superfamille du facteur de croissance transformant (TGF)-β et est induit par divers stimuli pathologiques, y compris les lésions tissulaires, l'inflammation et les insultes oncogènes. Sur la base des preuves accumulées, Gdf15 participe aux réponses homéostatiques cellulaires et joue un rôle protecteur dans les états physiologiques et pathologiques, y compris l'inflammation chronique et la tumorigenèse20,21,22,23. Étant donné que les niveaux d'expression tissulaire de Gdf15 sont fortement corrélés aux niveaux sécrétés de Gdf1524, les niveaux de Gdf15 circulants pourraient potentiellement représenter des lésions tissulaires. Notamment, les taux sanguins de Gdf15 ont été positivement associés à un dysfonctionnement rénal ou à des lésions au cours du vieillissement ou de la progression de la maladie, y compris la CKD24,25,26.

En réponse à divers facteurs de stress internes et externes, les cellules eucaryotes activent une voie adaptative commune, la réponse intégrée au stress (ISR), pour restaurer l'intégrité cellulaire. L'événement biochimique central de l'ISR est la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2 alpha (eIF2α) par la famille des kinases eIF2α, qui provoque un arrêt global de la traduction et l'induction de gènes spécifiques sensibles au stress pour atteindre l'homéostasie biologique27,28. Ici, nous avons déterminé si le stress cellulaire induit par l'ISR contribue aux résultats physiopathologiques via la modulation de Gdf15 au cours de la détresse réno-intestinale. Sur la base de l'hypothèse que Gdf15 est une molécule sensible au stress associée à une lésion tissulaire, ses actions dans la détresse réno-intestinale ont été prédites à l'aide des modèles cliniques de transcriptome et de lésion animale. En plus des effets rénaux indésirables, une niche spécifique à la muqueuse, y compris la communauté microbienne et la barrière épithéliale intestinale, a été abordée dans les communications interorganiques complexes entre l'intestin et le rein. Nos résultats fourniraient de nouvelles informations sur le pronostic et l'intervention de la détresse réno-intestinale.

Sur la base de l'hypothèse que les processus cellulaires liés à l'ISR sont impliqués dans la modulation de la détresse rénale, l'expression de quatre kinases eIF2α mammifères globales liées au stress, à savoir EIF2AK1 (HRI), EIF2AK2 (protéine kinase R ; PKR), EIF2AK3 (protéine kinase R -like endoplasmic reticulum kinase ; PERK) et EIF2AK4 (GCN2) ont été comparés chez des patients atteints d'IRA (Fig. 1a). L'expression d'EIF2AK2 (PKR) était nettement élevée par rapport aux niveaux d'expression d'autres kinases eIF2α de mammifères. L'analyse clinique basée sur le transcriptome a révélé que les patients atteints d'IRA ou d'IRC présentaient des taux élevés de PKR (Fig. 1b, c). Bien que les niveaux de PERK n'aient pas été significativement élevés chez les patients atteints d'IRA, des niveaux accrus ont été observés chez ceux atteints d'IRC (Figure supplémentaire s1a, b). Nous avons également analysé l'expression de Gdf15 associée à l'IRA et à l'IRC humaines dans des ensembles de données génomiques cliniques (GSE30718 et GSE66494, respectivement). Nous avons observé que l'expression relative de Gdf15 était significativement plus élevée chez les patients atteints d'IRA et d'IRC que dans le groupe témoin (Fig. 1d, e, respectivement). De plus, les sujets présentant des niveaux élevés de PKR ou de sa cible représentative, la protéine homologue C / EBP (CHOP), avaient tendance à présenter des niveaux de Gdf15 plus élevés que ceux présentant une faible expression de PKR ou de CHOP (Fig. 1f [AKI] et 1 g [CKD]) , indiquant ainsi une association positive entre la signalisation PKR et l'expression de Gdf15. En revanche, l'expression de PERK n'était pas associée de manière significative aux taux de Gdf15 chez les patients atteints d'IRA ou d'IRC (figures supplémentaires s1c, d, respectivement).

a Les niveaux d'expression des gènes de la kinase eIF2α (EIF2AK1, EIF2AK2, EIF2AK3 et EIF2AK4) ont été comparés chez chaque patient présentant une insuffisance rénale aiguë (GSE30718). b–e L'expression de PKR (b, c) ou de Gdf15 (d, e) a été déterminée chez des patients présentant des lésions rénales, y compris des lésions rénales aiguës (GSE30718, b et d) ou des maladies rénales chroniques (GSE66494, c et e). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey. Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les deux groupes (∗p < 0,05, ***p < 0,001). f–g Sur la base des niveaux de protéine homologue PKR ou C/EBP (CHOP), nous avons sélectionné les 20 échantillons de niveau le plus élevé et les 20 échantillons de niveau le plus bas, qui ont ensuite été évalués sur la base des niveaux de Gdf15 chez les patients présentant des lésions rénales, y compris des lésions rénales aiguës (GSE30718, f) ou maladie rénale chronique (GSE66494, g). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les groupes (∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01 en utilisant un test t de Student bilatéral non apparié). h – i Les cellules HK-2 ( h ) et les cellules HCT8 ( i ) transfectées avec le contrôle (le shRNA contrôle négatif) ou le plasmide shPERK ou shPKR ont été traitées avec le véhicule ou 10 μmol / L de cisplatine (CP) pendant 48 h. Les lysats cellulaires ont été soumis à une analyse Western blot. eIF2α, facteur d'initiation eucaryote 2 alpha ; Gdf15, facteur de différenciation de croissance 15 ; PKR, protéine kinase R; PERK, kinase du réticulum endoplasmique de type protéine kinase.

Le Gdf15 a été évalué mécaniquement comme un facteur induit par le stress en réponse à l'exposition au platine lors d'une détresse réno-intestinale. Conformément à l'évaluation transcriptomique clinique, la réponse au stress rénal au CP a été évaluée à l'aide de cellules HK-2, une lignée cellulaire épithéliale immortalisée du tubule proximal bien établie dérivée de reins humains adultes normaux29. De plus, les réponses au stress intestinal ont été simulées dans la lignée cellulaire HCT-8, un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines largement utilisé pour les maladies inflammatoires et infectieuses30,31. Sur la base de la viabilité cellulaire sur 24 h (Fig. s2a, b supplémentaire), les évaluations cellulaires suivantes ont été effectuées à des doses de CP correspondant aux valeurs de CI50 à chaque temps d'exposition donné. En réponse au traitement par CP, les cellules HK-2 et HCT-8 ont montré une expression accrue de Gdf15 (Fig. 1h, i). En plus du stress génotoxique, il a été constaté que la PC perturbe les fonctions des organites, y compris la machinerie traductionnelle, via une forte liaison à l'ARN et aux ribosomes32,33,34,35,36,37. Par conséquent, parmi les différents types de voies de signalisation liées à la kinase eIF2α dans l'ISR, les signaux associés à la PERK dépendante de l'ARN et à la PKR dépendante de l'ARN double brin ont été examinés pour déterminer leur impact possible sur les niveaux d'expression de Gdf15. De petits ARN en épingle à cheveux spécifiques (shARN) ont été utilisés pour abattre PERK ou PKR afin de déterminer leur impact sur l'expression de Gdf15. Par rapport à l'expression de PERK, PKR était nettement impliquée dans l'expression de Gdf15 induite par CP dans les deux types de cellules. Ces résultats ont confirmé que la signalisation liée à PKR est impliquée de manière critique dans l'expression de Gdf15 lors d'une lésion rénale.

Plus précisément, nous avons évalué si des niveaux élevés d'expression de Gdf15 étaient liés au pronostic de la pathologie rénale dans un modèle murin d'IRA induite par la CP. Le diagramme de survie de Kaplan-Meier a révélé que les souris déficientes en Gdf15 affichaient un pronostic plus sombre que les souris de type sauvage après un traitement CP (Fig. 2a); cela indiquait les actions protectrices médiées par Gdf15 contre les lésions rénales aiguës et les effets indésirables. L'observation anatomique grossière des reins a révélé des lésions tissulaires importantes chez les souris knock-out (KO) Gdf15 en réponse au traitement CP par rapport à celles des souris de type sauvage (Fig. 2b). Les taux de créatinine et d'azote uréique sanguin (BUN) ont été mesurés pour vérifier les lésions fonctionnelles rénales. Après le traitement par CP, les niveaux de créatine et de BUN étaient significativement plus élevés chez Gdf15 KO que chez les souris de type sauvage (Fig. 2c, d, respectivement). De plus, nous avons effectué une évaluation quantitative des lésions du tissu rénal à l'aide d'une coloration périodique à l'acide Schiff (PAS) (Fig. 2e) et avons trouvé un degré élevé de dilatation tubulaire et de vacuolisation tubulaire chez les souris Gdf15 KO par rapport à celui des souris de type sauvage dans réponse au CP (Fig. 2f, g). De plus, la formation de kystes induite par la CP était notable chez les souris Gdf15 KO par rapport à celle des souris de type sauvage (Fig. 2h). Dans l'ensemble, ces résultats ont indiqué un rôle protecteur pour Gdf15 contre les lésions rénales induites par le CP.

Des souris de type sauvage et knock-out (KO) Gdf15 âgées de huit semaines ont été traitées avec du véhicule ou du CP (20 mg / kg, intrapéritonéal) pendant 72 h ( n = 3 - 5). une analyse de survie de Kaplan-Meier de souris KO de type sauvage et Gdf15 traitées avec CP (n = 3 - 5, p < 0, 01). b Anatomie brute de coupes rénales de souris non traitées et de souris traitées par CP (coloration à l'acide périodique Schiff [PAS]) (grossissement, 5 ×; barres d'échelle, 1 mm). Les taux sériques de créatinine ( c ) et d'azote uréique sanguin (BUN) ( d ) ont été mesurés 72 h après le traitement CP à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique, comme décrit dans la section méthode. Les résultats sont présentés sous forme de graphique à barres avec moyenne et écart type, et différentes lettres sur chaque barre représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). e Examen histologique de coupes de rein colorées au PAS (grossissement, 400 x ; barres d'échelle, 50 μm). Analyse quantitative de la dilatation tubulaire (f), de la vacuolisation tubulaire (g) et de la formation de kystes (h). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Différentes lettres sur chaque barre représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

En plus de la détresse rénale, la mucosite est une complication connue associée à la complication induite par la PC14. Nous avons examiné les effets du déficit en Gdf15 sur la mucosite induite par la CP chez la souris. Sur la base d'observations anatomiques brutes, une carence en Gdf15 a aggravé de manière significative le raccourcissement induit par CP de l'intestin grêle de souris compte tenu de la longueur longitudinale (Fig. 3a). Après examen microscopique de la couche épithéliale intestinale, nous avons détecté un émoussement ou un raccourcissement des villosités ou des cryptes chez les souris exposées au CP, ce qui était nettement grave chez les souris Gdf15 KO (Fig. 3b, c). Le raccourcissement associé à Gdf15 de la longueur de la muqueuse, des villosités et des cryptes a suggéré une réduction de la surface luminale de l'intestin grêle disponible pour l'absorption des nutriments. De plus, la notation histopathologique de la gravité pathologique a révélé qu'une déficience en Gdf15 pouvait aggraver la perte de crypte induite par la CP (Fig. 3d – g). Notamment, la déficience en Gdf15 a augmenté l'inflammation et l'ulcération, qui étaient plus prononcées dans l'iléon que dans le jéjunum (Fig. 3f, g).

Des souris de type sauvage et knock-out (KO) Gdf15 âgées de huit semaines (n = 3–5) ont été traitées avec du véhicule ou du cisplatine (CP; 20 mg / kg) pendant 72 h. a La longueur moyenne de l'intestin grêle de chaque groupe. b–c Longueurs moyennes des villosités (à gauche) et de la crypte (à droite) dans le jéjunum (b) et l'iléon (c). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les différentes lettres sur les barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). d–g Examen histologique de coupes colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) du jéjunum (d) et de l'iléon (e) (grossissement, 100 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm). Quantification de la gravité pathologique du jéjunum (f) et de l'iléon (g). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les groupes (∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001 en utilisant un test t de Student bilatéral non apparié). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

En plus des lésions intestinales induites par le CP, nous avons évalué un modèle de colite ulcéreuse bien défini utilisant du sulfate de sodium dextran (DSS). En réponse au traitement DSS, les souris Gdf15 KO ont présenté des niveaux accrus d'inflammation, d'ulcération, de perte de crypte et d'œdème dans le côlon par rapport à ceux des souris de type sauvage (Fig. 4a, b). Nous avons évalué un modèle représentatif de maladie rénale chronique via un traitement avec un régime riche en graisses (HFD) (Figure supplémentaire s3). Dans ce modèle, nous n'avons pas pu trouver de défauts histologiques notables dans l'intestin alors que l'exposition chronique au HFD (12 semaines) a provoqué des lésions rénales telles qu'une dilatation tubulaire. Cependant, Gdf15 n'a pas contribué aux événements pathologiques rénaux induits par HFD. En partant du principe que les lésions intestinales sont associées à des effets indésirables sur les reins, nous avons en outre déterminé si l'insulte induisant une colite affecte l'intégrité rénale. Les animaux atteints de colite ulcéreuse induite par le sulfate de sodium dextran (DSS) présentaient des résultats pathologiques dans le rein, y compris des niveaux élevés de BUN et une dilatation tubulaire, qui étaient des animaux Gdf15 KO notables (Fig. 4c, d). En plus de la détresse tubulaire, nous avons constaté que le déficit en Gdf15 augmentait les lésions glomérulaires, y compris le rétrécissement morphologique et l'infiltration de neutrophiles dans le modèle de colite induite par le DSS (Fig. 4e). Collectivement, le déficit en Gdf15 a contribué aux altérations histologiques et à la gravité pathologique dans les modèles de lésions réno-intestinales.

Des souris de type sauvage et knock-out (KO) Gdf15 âgées de huit semaines (n = 3-5) ont été traitées avec un véhicule ou 3% de DSS pendant 8 jours. Examen histologique de coupes de côlon colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) (a). Quantification de la gravité pathologique du côlon (b) (grossissement, 200 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les groupes (∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001). c Examen histologique de coupes de rein colorées à l'acide périodique Schiff (PAS) (grossissement, 400 × ; échelle(s), 50 μm). d L'azote uréique sanguin (BUN) a été mesuré 48 h après le traitement au DSS à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique. Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey. Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les groupes (**p < 0,01). e Analyse quantitative de la dilatation tubulaire, du rétrécissement glomérulaire et de la sclérose glomérulaire. Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les deux groupes (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

La couche muqueuse intestinale a été évaluée plus en détail, étant donné qu'il s'agit d'une barrière essentielle contre les déclencheurs pro-inflammatoires, y compris les microbes et leurs composants. Compte tenu de la défense muqueuse, l'exposition au CP a réduit le nombre de cellules caliciformes et la sécrétion de mucus dans la couche épithéliale iléale, ce qui a été encore exacerbé chez les souris Gdf15 KO (Fig. 5a, b). En plus de l'intestin grêle, une carence en Gdf15 a appauvri la sécrétion de mucine colique, indiquant ainsi la fonction protectrice de Gdf15 pour les cellules caliciformes ou leur production de mucine. Par conséquent, Gdf15 KO a également induit une perte sévère de la couche muqueuse dans le modèle de colite induite par le DSS (Fig. 5c). Une coloration de Gram a été réalisée pour localiser les bactéries luminales et estimer l'épaisseur de la couche muqueuse interne. Les cellules épithéliales déficientes en Gdf15 étaient en contact étroit avec la matière luminale contenant des facteurs alimentaires et microbiens, compte tenu de la barrière muqueuse réduite (Fig. 5d). Par la suite, les bactéries luminales pourraient facilement se transloquer dans les tissus internes et jouer un rôle crucial dans le déclenchement d'insultes inflammatoires dans le système vasculaire et d'autres organes cibles, y compris les reins. Les preuves actuelles suggèrent que l'intégrité médiée par Gdf15 de la barrière épithéliale et muqueuse contrecarre la libération circulatoire de facteurs rénotoxiques ou pro-inflammatoires dérivés de l'intestin.

a Des souris de type sauvage et knock-out (KO) Gdf15 âgées de huit semaines (n = 3-5) ont été traitées avec du véhicule ou du cisplatine (CP; 20 mg / kg) pendant 72 h. Coloration de la muqueuse iléale au bleu Alcian (grossissement, 200 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm) et sa quantification (grossissement, 200 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm). b – d Des souris de type sauvage et Gdf15 KO âgées de huit semaines (n = 3–5) ont été traitées avec du véhicule ou du DSS à 3% pendant 8 jours. Coloration de la muqueuse iléale au bleu Alcian (grossissement, 200 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm) et sa quantification (grossissement, 200 x ; barre(s) d'échelle, 100 μm) (b). Images représentatives des bactéries de la muqueuse intestinale utilisant la coloration de Gram (c) ou la coloration in situ de 16 ARNr (d) (grossissement, 200 x ; barre d'échelle (s), 100 μm). L'épaisseur de la couche muqueuse a été mesurée (le graphique de droite). L'analyse de quantification a été présentée sous forme de tracés avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Différentes lettres avec des barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

En plus de la barrière tissulaire altérée de l'hôte, nous avons évalué la composition bactérienne luminale en tant qu'étiologie potentielle associée à la barrière intestinale aggravée, car les microbes muqueux peuvent moduler la synthèse ou la dégradation de la matrice muqueuse. Au total, 1 821 852 lectures appariées ont été produites à partir des trois bibliothèques à l'aide de la plateforme Illumina iSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA). Par la suite, les 1 821 852 lectures à extrémité unique ont été soumises à d'autres analyses à l'aide du pipeline QIIME2 (ver.2021.2). À l'aide de l'algorithme DADA2, 2 012 séquences représentatives de la région V4 de 16 gènes d'ARNr S, d'une longueur moyenne de 151 pb dans trois bibliothèques, ont été construites, parmi lesquelles 100047,6, 102951,5, 100358,5 et 114681,25 caractéristiques moyennes ont été comptées dans le type sauvage. (véhicule), Gdf15 KO (véhicule), de type sauvage (CDDP) et Gdf15 KO (CDDP), respectivement. La diversité alpha basée sur les mesures de Shannon, Simpson et Chao1 a révélé que le degré de diversité au sein de chaque communauté microbienne était similaire (Figure supplémentaire s4a). En revanche, la diversité bêta différait considérablement d'une communauté à l'autre (figure supplémentaire s4b). De plus, l'analyse de la composition des phyla a démontré que Firmicutes et Bacteroidota étaient les phyla les plus dominants dans tous les échantillons (Figure supplémentaire s4c). La composition différait d'un échantillon à l'autre, les Firmicutes contribuant à 56,9 et 59,6% des caractéristiques totales en tant que phylum le plus abondant dans les groupes véhicule et CDDP, respectivement, tandis que l'abondance relative de Bacteroidota était augmentée chez les souris Gdf15 KO (Figure supplémentaire s4a). De plus, le rapport des protéobactéries était de 9 fois sa valeur d'origine en réponse à l'exposition au CDDP chez les souris de type sauvage, alors que l'élévation induite par le CDDP de l'abondance des protéobactéries était marginale chez les animaux Gdf15 KO (Figure supplémentaire s4c). Une évaluation approfondie des communautés au niveau de la famille ou du genre a démontré que les Lachnospireae non classées, en tant que famille principale appartenant au phylum Firmicutes, contribuaient pour 25 à 32% dans chaque groupe (Fig. 6a). Cependant, Muribaculaceae était le genre principal du phylum Bacteroidota chez les animaux Gdf15 KO. Une évaluation plus poussée a été effectuée pour classer l'abondance relative des bactéries au niveau de l'espèce en réponse à une carence en Gdf15. En particulier, la carence en Gdf15 a augmenté l'abondance relative de Muribaculum intestinale, Duncaniella dubosii, Akkermansia muciniphila, Lachnospiraceae_UCG-006, Prevotellaceae, Bacteroidesvulgatus et Dubosiella (Fig. 6b et Figure supplémentaire s4d), qui ont tous été identifiés comme butineurs de glycane de mucine dans le microbiote intestinal humain38,39. De plus, la prédiction métagénomique basée sur le profil utilisant PICRUSt2 (ver.2.3.0) a démontré des élévations significatives des gènes codant pour les enzymes liées à la dégradation de la mucine en réponse au déficit en Gdf15 (Fig. 6c). En particulier, le déficit en Gdf15 a considérablement amélioré les niveaux d'expression des gènes de la sialate O-acétylestérase (EC:3.1.1.53), de l'arylsulfatase N-acétylgalactosamine-4-sulfatase (EC:3.1.6.1), de l'exo-alpha-sialidase (EC:3.1. 6.12), bêta-mannosidase (EC:3.2.1.18), alpha-l-fucosidase (EC:3.2.1.25), bêta-N-acétylhexosaminidase (EC:3.2.1.51) et endo-alpha-N-acétylgalactosaminidase (EC :3.2.1.52). Pris ensemble, le déficit en Gdf15 a augmenté de manière concomitante l'abondance de bactéries et d'enzymes liées au métabolisme de la mucine ainsi que la perturbation de la barrière muqueuse, indiquant que Gdf15 neutralise la dégradation de la mucine induite par les microbes.

Les bactéries fécales ont été soumises à une analyse d'ARNr 16 S pour déterminer la composition phylogénétique. a,b Les bactéries de chacun des 30 taxons les plus abondants sont répertoriées avec l'abondance correspondante (a) et l'abondance relative (b). Les microbes re-marqués sont de puissants genres ou espèces qui se nourrissent de mucine. c Gènes liés aux enzymes de dégradation de la mucine reconstruits à partir du profil d'ARNr 16 S avec PICRUSt2. Les données représentent la moyenne ± écart type (SD) (N = 3) avec tous les points de données (cercles) (les résultats sont présentés sous forme de valeurs moyennes ± SD. Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives entre les groupes (∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001) Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

Compte tenu de la contre-action médiée par Gdf15 contre les lésions réno-intestinales, l'autophagie a été évaluée comme l'un des mécanismes de protection représentatifs. Tout d'abord, nous avons évalué l'implication de Gdf15 dans le flux autophagique dans les cellules intestinales et rénales à l'aide du plasmide pour l'expression de la chaîne légère 1 A/1B associée aux microtubules mCherry et GFP (LC3B), un marqueur autophagosome représentatif. (Fig. 7a, b). La fusion d'autophagosomes avec des endosomes ou des lysosomes tardifs donne des autolysosomes acides où le signal de la GFP sensible à l'acide est perdu. De plus, le signal de mCherry insensible aux acides est finalement perdu lorsque la protéine à double étiquette est dégradée. Les cellules CP-insultées ont présenté une formation d'autophagosome (le point jaune), qui a été suivie par la formation d'autolysosome (le rouge) pour la clairance des protéines ubiquitinylées sous stress chimique. Cependant, les cellules déficientes en Gdf15 ont montré des défauts dans le flux autophagique normal. La formation d'autolysosomes a été remarquablement entravée dans l'inactivation de Gdf15, ce qui a entraîné un signal prolongé du point jaune avec des niveaux atténués de point de fluorescence rouge (Fig. 7a, b), suggérant le rôle central de Gdf15 dans la facilitation du flux autophagique.

Des cellules témoins ou déficientes en Gdf15 (cellules HCT-8 (a) ou HK-2 (b)) ont été transfectées avec pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT. 24 h après la transfection, les cellules ont été traitées avec le véhicule ou 10 μmol/L de cisplatine (CP) pendant 48 h. Les cellules ont été observées au microscope confocal pour surveiller le flux autophagique sensible au pH (grossissement, 400 ×; barre (s) d'échelle, 10 μm). L'analyse de quantification a été présentée sous forme de tracés avec des moustaches de Tukey (graphiques inférieurs) et tous les points de données (cercles). Différentes lettres avec des barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

Ensuite, nous avons étudié le lien mécaniste entre Gdf15 et la protection muqueuse. En conséquence, l'autophagie a été évaluée comme l'un des mécanismes de signalisation protecteurs contre la mucosite induite par des produits chimiques. Nous avons noté que les cellules intestinales renversées par Gdf15 présentaient une activation réduite de LC3B (Fig. 8a), indiquant ainsi que Gdf15 régule positivement l'autophagie. De plus, nous avons observé p62, un récepteur du cargo destiné à être dégradé par l'autophagie, qui se lie à l'ubiquitine et au LC3, facilitant la clairance des protéines ubiquitinées dans l'autolysosome. Bien que p62 ait finalement été dégradé dans les cellules intestinales exposées au CP, les cellules déficientes en Gdf15 ont montré une résistance au processus de dégradation induit par le CP. Compte tenu de la protection intestinale médiée par la muqueuse, l'évaluation in vitro utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines a démontré l'expression dépendante de Gdf15 des mucines 2 et 4 (Fig. 8b). De plus, l'inhibition de la signalisation de l'autophagie a atténué l'induction de la mucine 2/4 en réponse à la détresse induite par la CP, ce qui indique que la signalisation de l'autophagie médiée par Gdf15 participe à l'expression de la mucine intestinale.

a Des cellules HCT8 transfectées avec le vecteur contrôle ou shGdf15 ont été traitées avec le véhicule ou 10 μmol/L de cisplatine (CP) pendant 48 h. Les lysats cellulaires ont été soumis à une analyse Western blot. b Les cellules HCT-8 transfectées avec le contrôle (le shRNA contrôle négatif) ou le plasmide shGdf15 ont été traitées avec le véhicule ou 10 μmol/L de CP en l'absence ou en présence de 20 μmol/L de 3-méthyladénine (3-MA) ​​pendant 48 h, et Les niveaux d'ARNm de la mucine 4 ou de la mucine 2 ont été mesurés à l'aide d'une analyse de réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR). Les valeurs des données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD) et tous les points de données (cercles). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives par rapport au groupe traité par CP (∗∗∗p < 0,001). Les transferts en boîte indiquent la suppression efficace de Gdf15 à l'aide de shRNA. c Évaluation en grappe du réseau de régulation de l'autophagie (ARN; https://autophagyregulation.org) en réponse aux niveaux de Gdf15 dans les cellules humaines. L'épaisseur de la bordure indique les niveaux de centralité intermédiaire de chaque nœud. d Les cellules HCT-8 transfectées avec le contrôle (le shRNA de contrôle négatif) ou le plasmide shGdf15 ont été traitées avec un véhicule ou 20 μmol/L CP pendant 12 h, et les niveaux d'ARNm ont été mesurés à l'aide d'une analyse RT-qPCR. Les valeurs des données sont présentées sous forme de moyenne ± SD et de tous les points de données (cercles). Les différentes lettres sur les barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

Pour aborder le réseau de signalisation détaillé impliqué dans l'autophagie induite par Gdf15, nous avons effectué une analyse bioinformatique systématique de l'expression de Gdf15 dans les cellules humaines à l'aide de la base de données du réseau de régulation de l'autophagie (ARN), qui englobe divers composants liés à la machinerie de l'autophagie fondés sur des preuves, leurs régulateurs, facteurs de transcription, régulateurs de miARN et connecteurs de réseau de signalisation dans une illustration multicouche40. Sur la base du profil du gène humain sensible au Gdf15 dans les cellules intestinales, nous avons identifié deux groupes de signalisation de l'autophagie associée aux récepteurs (Fig. 8c). Nous avons constaté que Gdf15 améliorait la protéine associée au récepteur de l'acide gamma-aminobutyrique 1 (GABARAPL1) dans le système de hiérarchie de signalisation, qui médie la transduction du signal par le biais d'interactions protéine-protéine et régule négativement le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes du récepteur nucléaire (PPAR-γ) -réseau transcriptionnel régulé. GABARAPL1 et PPAR-γ sont des composants clés avec une centralité élevée de l'ARN en réponse aux niveaux de Gdf15. De plus, les facteurs de transcription de haut degré modulés par GABARAPL1, tels que Sp1 et le gène de réponse de croissance précoce 1 (Egr1), ont contribué aux altérations du réseau sensible à Gdf15. De plus, nous avons examiné les modules critiques régulés par Gdf15 du réseau d'autophagie dans les cellules intestinales humaines exposées au CP. L'exposition de l'épithélium intestinal au CP a légèrement amélioré l'expression de GABARAPL1, qui était régulée positivement par Gdf15 (Fig. 8d). En revanche, le stress chimique a régulé négativement l'expression de PPARγ.

Ensuite, nous avons cherché à prédire le lien entre l'autophagie et les lésions du tissu rénal. Bien que le rôle précis de l'autophagie dans les maladies rénales reste controversé, les patients atteints d'IRA ont tendance à présenter des niveaux réduits de Beclin-1 (BEC1), un biomarqueur représentatif de l'autophagie (Fig. 9a). L'analyse du transcriptome clinique a également révélé que les sujets présentant une expression élevée de Gdf15 avaient tendance à présenter des niveaux accrus de BEC1 lors d'une lésion rénale aiguë ou chronique (Fig. 9b). Expérimentalement, les souris Gdf15 KO présentaient une expression réduite de LC3B II, un marqueur autophagosome représentatif (Fig. 9c), indiquant ainsi que Gdf15 régule positivement l'autophagie. Conformément aux niveaux d'expression du tissu rénal, l'inactivation de Gdf15 dans les cellules HK2 a atténué le niveau d'activation de LC3B (Fig. 9d). De plus, les cellules déficientes en Gdf15 présentaient des niveaux accrus de p62, un récepteur du cargo destiné à être dégradé par l'autophagie, indiquant que Gdf15 contribue au processus d'autolysosome ainsi qu'à la formation d'autophagosome dans les cellules tubulaires rénales. En revanche, la suppression de Gdf15 a augmenté la mort des cellules rénales induite par la CP (clivage PARP1/2), indiquant les effets protecteurs de Gdf15 via la signalisation autophagique en réponse à l'exposition à la CP. De plus, l'inhibition de la signalisation de l'autophagie a aggravé la mort des cellules rénales induite par la CP (Fig. 9e). Collectivement, Gdf15 et sa voie d'autophagie en aval offrent mécaniquement une protection contre la mort des cellules rénales.

a Expression de BECN1 chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (GSE30718). b Sur la base des niveaux de Gdf15 chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (GSE30718, à gauche) ou d'insuffisance rénale chronique (GSE66494, à droite), nous avons sélectionné les 20 échantillons de niveau le plus élevé et les 20 échantillons de niveau le plus bas, suivis d'une comparaison des niveaux d'expression de BECN1. Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey. Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives par rapport au groupe à faible expression (∗p < 0,05 en utilisant un test t de Student non apparié à deux queues). c Des souris de type sauvage et knock-out (KO) Gdf15 âgées de huit semaines (n = 3–5) ont été traitées avec du véhicule ou du cisplatine (CP; 20 mg / kg) pendant 72 h. Les lysats de tissus rénaux ont été soumis à un Western Blot. Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey. Le graphique montre les densités relatives de la chaîne légère 3B (LC3B) du transfert Western. Les différentes lettres sur les barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05, n = 3). d Les cellules HK-2 transfectées avec le vecteur contrôle ou shGdf15 ont été traitées avec le véhicule ou 10 μmol/L de CP pendant 48 h. Les lysats cellulaires ont été soumis à une analyse Western blot. Les cellules HK-2 ont été traitées avec un véhicule ou 10 μmol/L de CP en l'absence ou en présence de 20 μmol/L de 3-méthyladénine (3-MA) ​​pendant 48 h. Les lysats cellulaires ont été soumis à une analyse Western blot. Gdf15, facteur de différenciation de la croissance 15.

Enfin, l'analyse du transcriptome clinique a vérifié la signalisation de l'autophagie chez les patients souffrant de détresse rénale aiguë. Compte tenu des réponses au stress intégrées lors d'une lésion rénale, la signalisation de stress médiée par la kinase PKR eIF2α était impliquée de manière critique dans l'induction de Gdf15 lors d'une lésion rénale et d'une exposition à la CP (Fig. 1). En conséquence, nous avons évalué l'expression de GABARAPL1 et les niveaux de PKR chez les patients atteints d'IRA. Les sujets présentant des niveaux élevés de PKR présentaient une expression accrue de GABARAPL1, indiquant que l'ISR améliore l'expression de GABARAPL1 (Fig. 10a). De plus, GABARAPL1 sensible à la PKR était positivement associé à des niveaux améliorés de BECN1, un biomarqueur de l'autophagie dans les tissus rénaux lésés (Fig. 10b). De plus, les patients présentant des taux élevés de Gdf15 avaient tendance à présenter des taux accrus de GABARAPL1 et une diminution de l'expression de PPARγ, suggérant un réseau d'autophagie altéré par Gdf15 lors d'une détresse rénale aiguë (Fig. 10c). De plus, la prédiction liée à la base de données cliniques des modèles de régulation de deux molécules clés du réseau d'autophagie, GABARAPL1 et PPAR-γ, était similaire à celles observées dans les cellules tubulaires rénales exposées au CP (Fig. 10d). Collectivement, le Gdf15 sensible au stress a modulé le réseau de signalisation de l'autophagie, contribuant au maintien de l'intégrité de la muqueuse et à la survie des cellules rénales dans l'axe intestin-rein en détresse (Fig. 10e).

a Sur la base des taux de protéine kinase R (PKR) chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (GSE30718), nous avons sélectionné les 20 échantillons les plus élevés et les 20 échantillons les plus bas, suivis d'une comparaison de la protéine de type 1 associée au récepteur de l'acide gamma-aminobutyrique (GABARAPL1). b Sur la base des niveaux de GABARAPL1 chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (GSE30718), nous avons sélectionné les 20 échantillons les plus élevés et les 20 échantillons les plus bas, suivis d'une comparaison de l'expression de BECN1. c Sur la base des niveaux de Gdf15, nous avons sélectionné les 20 échantillons les plus élevés et les 20 échantillons les plus bas, suivis d'une comparaison de l'expression de GABARAPL1 (à gauche) et de PPAR-γ (à droite) chez les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë (GSE30718). Les résultats sont présentés sous forme de graphique avec des moustaches de Tukey et des valeurs aberrantes (cercles orange). Les astérisques (∗) indiquent des différences significatives par rapport au groupe à faible expression (*p < 0,05, **p < 0,01 en utilisant un test t de Student non apparié à deux queues). d Les cellules HK-2 transfectées avec le contrôle (le shRNA de contrôle négatif) ou le plasmide shGdf15 ont été traitées avec un véhicule ou 20 μmol / L de cisplatine (CP) pendant 12 h, et les niveaux d'ARNm ont été mesurés à l'aide d'une analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse. Les valeurs des données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD), et différentes lettres sur les barres représentent des différences significatives entre les groupes (p < 0,05). e Schéma mécaniste de la protection liée au Gdf15. Les cellules activent des réponses de stress intégrées suite à des insultes tubulaires ou muqueuses, conduisant à la production de Gdf15. Gdf15 sensible au stress joue un rôle crucial dans la réorganisation du réseau de régulation de l'autophagie pour l'adaptation endogène, y compris la production de mucine intestinale et la survie des cellules rénales contre les lésions cytotoxiques. De plus, le Gdf15 lié à la protection a contrecarré le microbiote dégradant le mucus dans l'intestin en détresse. Gdf15, Facteur de différenciation de la croissance 15 ; PPAR-γ, récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes.

Dans la présente étude, Gdf15 a été évalué comme une molécule d'adaptation endogène contre le stress pathologique. Notamment, Gdf15 activé par ISR a facilité la protection cellulaire via la reprogrammation de signalisation du réseau d'autophagie en réponse à une lésion tissulaire. En plus de la protection des cellules rénales, la signalisation autophagique liée à Gdf15 était impliquée dans le maintien de la barrière intestinale via la régulation de la production de mucine contre le microbiote dégradant le mucus au cours de la lésion rénale. Les prédictions et les preuves basées sur des ensembles de données cliniques et des expériences sur la protection médiée par Gdf15 fournissent des informations sur des cibles robustes pour la prévention moléculaire ou l'intervention contre les lésions intestinales et rénales. Le Gdf15 a également été évalué comme un biomarqueur précoce de diverses lésions tissulaires, régulant l'inflammation, la survie cellulaire, la prolifération et l'apoptose au cours de la progression de la maladie41. De plus, des taux sériques accrus de Gdf15 ont été associés à un risque accru de progression de l'IRC, indiquant en particulier son utilité en tant que marqueur de l'insuffisance rénale chez les personnes âgées et les populations jeunes25,42. De plus, les taux urinaires de Gdf15 peuvent être associés à des effets indésirables, à des schémas histologiques rénaux et à la nécessité d'un traitement de remplacement rénal chez les patients atteints de CKD43. La transplantation rénale réduirait les taux sériques de Gdf15, alors que la néphrectomie régulerait ces taux à la hausse, indiquant que le Gdf15 rénal régule diverses fonctions physiologiques44. Ici, le Gdf15 lié à l'ISR pourrait être un biomarqueur pronostique précieux pour la détresse réno-intestinale aiguë, mais des évaluations supplémentaires sont justifiées pour généraliser la prédiction dans diverses autres lésions rénales

Gdf15 facilite la réorganisation de l'ARN en réponse au stress cellulaire. Cependant, les preuves mécanistes concernant la régulation de l'autophagie médiée par Gdf15 restent limitées. En termes de preuve indirecte de l'action de Gdf15 dans l'autophagie, il a été démontré que Gdf15 combiné à une lipoprotéine de basse densité oxydée altère les processus autophagiques en régulant l'expression de protéines pertinentes pour l'autophagie dans les macrophages humains lors de la formation de plaques d'athérosclérose45. Dans la machinerie de l'autophagie, il a été prédit que GABARAPL1 serait un médiateur de signalisation protecteur dans la pathogenèse rénale liée à la PKR après l'induction de Gdf15. Dans les cellules de mammifères, les membranes cargo sont reconnues et conjuguées par la famille des protéines 8 liées à l'autophagie, y compris les protéines GABARAP ou LC3, qui jouent un rôle essentiel dans le flux autophagique. Bien que LC3 soit impliqué dans l'allongement de la membrane du phagophore, les GABARAP, y compris GABARAPL1, sont essentiels à l'extension et à l'étanchéité du phagophore, entraînant la maturation de l'autophagosome48. De plus, la sous-famille GABARAP régule positivement ULK1 (Unc-like autophagy activating kinase1), une kinase clé sensible au stress qui initie la machinerie d'autophagie en réponse à des facteurs de stress internes ou externes, y compris la signalisation de stress nutritif et métabolique49. Dans la présente étude, l'expression de PKR et de Gdf15 sensibles au stress était positivement associée à l'expression de GABARAPL1 chez les patients présentant une lésion rénale aiguë, ce qui pourrait faciliter la formation et la maturation précoces de l'autophagie en tant que processus cellulaire protecteur contre les lésions épithéliales tubulaires rénales et intestinales. Bien que le rôle de l'autophagie dans les lésions rénales doive être complètement élucidé, l'autophagie précoce sensible au stress peut être associée à une réponse adaptative qui supprime la mort cellulaire et améliore par la suite la survie des cellules tubulaires rénales pendant les lésions rénales50. Diverses voies de signalisation sont connues pour influencer les voies moléculaires liées à l'autophagie. Les résultats pathologiques induits par la PC ont été associés négativement à l'activation de l'autophagie protectrice via des médiateurs de signalisation biochimiques liés à la reprogrammation métabolique, y compris la protéine kinase alpha activée par l'adénosine monophosphate et la sirtuine-3, lors de lésions rénales aiguës51,52. De plus, la machinerie autophagique séquestre les lysosomes endommagés dans les cellules rénales, qui sont engloutis via la formation d'autophagosomes, entraînant une homéostasie lysosomale et une intégrité cellulaire saine pendant l'AKI53. De plus, le processus de dégradation intracellulaire lié à l'autophagie joue un rôle crucial dans les cellules intestinales sécrétant de la mucine pour faire face aux réponses au stress des protéines dépliées54,55. Des niveaux excessifs de biosynthèse de la mucine avec une voie d'autophagie défectueuse peuvent perturber l'homéostasie intestinale. Contrairement à l'autophagie protectrice, la signalisation de l'autophagie a été associée à des effets néfastes via des réponses pro-inflammatoires dans un modèle de lésion rénale associée à une endotoxine56. Notamment, l'autophagie peut offrir une protection contre un léger degré de lésion rénale d'ischémie-reperfusion; cependant, cet effet n'est pas observé dans les cas de blessures graves57. De plus, il a été démontré que l'activation persistante de l'autophagie dans les tubules proximaux du rein stimule la fibrose interstitielle rénale dans un modèle murin58. Par conséquent, la contribution précise des cellules rénales et intestinales au cours de l'autophagie doit être soigneusement évaluée en fonction de la gravité et de la progression de la maladie.

Dans la présente étude, la signalisation de l'autophagie était associée à l'ISR médiée par la PKR dans le modèle de lésion rénale aiguë utilisant le traitement CP. La CP induit une génotoxicité en formant des adduits à l'ADN, qui interfèrent avec la réplication génétique et les réponses au stress cellulaire. Cependant, les résultats pathologiques induits par le CP peuvent être associés à plusieurs mécanismes, y compris le blocage de la synthèse d'ARN ou sa liaison directe à l'ARN35,36,37. Les adduits CP-ADN se sont avérés présenter une activité de liaison élevée aux protéines du domaine du groupe à mobilité élevée telles que le facteur de liaison en amont humain, qui peut interférer avec la liaison au promoteur du gène de l'ARN ribosomique (ARNr)35,37. De plus, CP intercale directement les ribosomes et l'ARNm, entraînant un blocage ribosomal, ainsi qu'une traduction globale supprimée36. Le blocage ribosomal induit par le stress déclenche une inhibition globale de la traduction médiée par eIF2α via PKR, une voie biochimique primaire dans l'ISR27, 59, 60, 61. L'ISR liée à la PKR peut être activée par divers facteurs de stress internes et externes, notamment une infection virale, une inhibition spécifique de la traduction, un stress oxydatif et ER, une privation de facteur de croissance et une infection bactérienne27,62. Notamment, l'activation de la PKR liée au stress ribosomal est un mécanisme puissant impliqué dans les troubles inflammatoires et chroniques via des profils déséquilibrés de cytokines et de facteurs de croissance63,64,65. De plus, les événements liés à la PKR peuvent être associés à un stress pathologique rénal généralisé plutôt qu'à une toxicité rénale spécifique à un produit chimique, car les patients atteints d'IRA et d'IRC présentaient de tels liens indépendamment de l'exposition au platine (Fig. 1). Par conséquent, de nombreuses preuves moléculaires sont nécessaires pour déterminer si la signalisation sensible au stress facilite les résultats indésirables ou restaure l'homéostasie biologique dans diverses lésions rénales.

En conclusion, le Gdf15 sensible au stress s'est avéré être une molécule d'adaptation contre les lésions réno-intestinales aiguës. L'expression de Gdf15 dépendait de l'activation de la signalisation médiée par l'ISR liée à PKR, qui a été vérifiée par une analyse clinique du transcriptome chez des patients atteints de lésions rénales. En particulier, le Gdf15 sensible au stress était impliqué dans le maintien de l'intégrité des muqueuses intestinales et des cellules rénales. Mécaniquement, Gdf15 a contrôlé la détresse réno-intestinale aiguë en facilitant la production de mucine et la protection cellulaire via la réorganisation de la signalisation autophagique protectrice des cellules. De plus, Gdf15 était associé à la régulation de la communauté bactérienne dégradant le mucus. Collectivement, les réponses d'adaptation endogène sensibles au stress pourraient contrecarrer les processus pathologiques dans l'axe de signalisation du réseau ISR-Gdf15-autophagie, ouvrant ainsi une nouvelle stratégie pour le développement de biomarqueurs prédictifs et d'interventions contre la détresse réno-intestinale.

L'expression des gènes rénaux a été évaluée chez des patients atteints d'IRA (gse30718, n = 47) ou d'IRC (gse66494, n = 61). L'analyse de l'expression génique des reins humains atteints d'IRA est limitée car ces reins sont rarement biopsiés66. Compte tenu de l'offre limitée d'échantillons de biopsie rénale de patients atteints d'IRA, les patients ayant subi des explants rénaux ont été suivis en tant que modèles d'IRA humaine66. Étant donné que tous les sujets ayant subi une greffe de rein souffrent d'IRA, les greffes de rein précoces sans rejet sont un excellent modèle pour l'IRA humaine. Les biopsies des greffes avec AKI (gse30718) ont été comparées à celles des biopsies du protocole vierge des greffes stables.

Les patients atteints d'IRC présentent une perte irréversible et progressive des néphrons, suivie d'une fibrose glomérulaire, d'une atrophie tubulaire et d'une fibrose tubulo-interstitielle, qui sont des caractéristiques couramment observées dans les maladies rénales progressives humaines, quelles que soient les étiologies initiales67. Des échantillons de biopsie de 48 patients atteints d'IRC confirmée histopathologiquement (gse66494) ont été analysés pour identifier les gènes responsables de la fibrose tubulo-interstitielle et des lésions des cellules tubulaires à l'aide de deux processus de découverte et de validation indépendants67. Les patients présentaient divers types histologiques de maladies rénales, notamment une néphropathie à IgA (n = 15), une néphropathie membraneuse (n = 7), une néphrite lupique (n = 6), un syndrome néphrotique à changement minime (n = 3), une glomérulonéphrite membranoproliférative (n = 3 ), amylose (n = 3), glomérulonéphropathie liée aux anticorps cytoplasmiques antineutrophiles (n = 2), néphropathie diabétique (n = 2) et autres néphropathies (n = 6).

Dans la présente étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine HCT-8 et des cellules rénales humaines (HK-2 et HEK293). Les lignées cellulaires sans mycoplasme ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection et maintenues dans du milieu RPMI 1640 ou DMEM (Welgene) additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (Welgene), de pénicilline 50 U/mL et 50 µg/mL de streptomycine (Welgene) à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2. Les cellules ont été ensemencées à une densité de 5 x 105 cellules dans une boîte de 60 mm, et le milieu de culture a été réapprovisionné lorsque les cellules ont atteint la confluence. Après avoir reconstitué le milieu pendant 12 h, du CP (10 μmol/L) dans une solution saline normale a été ajouté à la culture cellulaire pendant 24 ou 48 h. Par la suite, les cellules ont été récoltées pour l'extraction des protéines et de l'ARN. La poudre de CP a été achetée chez Sigma-Aldrich (#PHR1624) et les solutions mères ont été préparées dans une solution saline normale. Le comptage et la viabilité des cellules ont été dosés en utilisant le test d'exclusion de colorant avec le colorant bleu Trypan (Merck) avec un hémocytomètre.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68. En détail, des souris C57BL/6 (mâle de 6 semaines, poids moyen de 16 à 18 g) ont été achetées chez Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA), et des souris Gdf15 KO C57BL/6 ont été gracieusement fournies par le Dr Se -Jin Lee (Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, États-Unis). Toutes les souris du même âge ont été placées dans une cage et transférées au hasard dans différentes cages sans biais. Les souris ont été assignées au hasard à des groupes de traitement spécifiques. Les souris ont été acclimatées pendant 14 jours avant l'expérimentation et maintenues à 22 ± 2 °C sous une humidité relative de 45 à 55 %, avec un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. Trois souris ont été logées par cage et ont fourni suffisamment de nourriture et d'eau dans des cages protégées de l'environnement, comprenant un corps en polypropylène transparent et un couvercle supérieur en acier inoxydable. L'IRA induite par la chimiothérapie a été induite par une injection intrapéritonéale de cisplatine (20 mg/kg). Des souris de type sauvage et Gdf15 KO âgées de huit semaines ont été traitées avec du véhicule ou du CP (20 mg / kg, par voie intrapéritonéale) pendant 72 h ( n = 4 - 5). Pour induire une colite et des complications rénales induites par le DSS, des souris mâles âgées de sept semaines ont été traitées avec 3% de DSS (poids moléculaire 36 000–50 000 Da; MP Biomedical, Solon, OH, USA) ad libitum dans de l'eau potable pendant huit jours. Deux jours plus tard, les souris ont été sacrifiées sous anesthésie profonde à l'éther.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. En bref, des coupes de rein ont été colorées avec du PAS et des microphotographies de coupes préparées ont été obtenues à l'aide d'un microscope inversé (Nikon-Eclipse Ts2R, Tokyo, Japon). Les images obtenues ont été quantifiées à l'aide d'Adobe Photoshop CS6 et de Multi Gauge V3.0. Une partie du rein récolté a été fixée dans du PFA à 4 % à 4 °C, noyée dans de la paraffine et colorée au PAS ; l'autre partie a été segmentée en deux portions pour l'isolement de l'ARN et des protéines, congelée instantanément dans de l'azote liquide à -120 ° C pendant 10 à 15 min et homogénéisée le jour du prélèvement des organes. Le degré de lésion tubulaire rénale était exprimé en proportion de tubules rénaux endommagés70. Pour l'analyse statistique, les champs visuels de chaque spécimen ont été sélectionnés au hasard, et les diamètres des tubules et des lumières ont été photographiés au microscope, et les lésions ont été analysées statistiquement par le logiciel ImageJ. Les diamètres des tubules ont été mesurés à partir de la membrane basale à travers le segment le plus étroit d'un tubule jusqu'à la membrane basale du côté opposé. Les diamètres des lumières ont été déterminés en mesurant la distance entre les membranes apicales à travers la partie la plus étroite d'un tubule. Les niveaux de vacuolisation tubulaire ont été évalués en graduant les niveaux de vacuoles affectant les tubules proximaux et s'étendant jusqu'à la membrane basale71. L'indice kystique a été calculé comme le pourcentage de surface kystique par rapport à la surface rénale totale72.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Pour l'analyse intestinale, l'intestin grêle a été immédiatement retiré, fixé dans la solution de Carnoy et inclus dans de la paraffine. Les coupes ont été déparaffinées à l'aide de xylène, réhydratées à l'aide d'une série de solutions alcoolisées graduées et colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) en utilisant un protocole de laboratoire établi pour révéler les lésions histopathologiques. Les longueurs des villes et des cryptes du jéjunum et de l'iléon ont été mesurées à l'aide d'un micromètre. Au moins neuf villosités de chaque section ont été mesurées et moyennées pour chaque groupe. L'évaluation morphologique a été réalisée en aveugle en utilisant des critères bien établis. En bref, des coupes transversales colorées à l'H&E de tissus de l'intestin grêle ont été notées sur une échelle de 0 à 4 pour déterminer la gravité histopathologique sur la base des critères suivants : 0, aucun changement par rapport aux tissus normaux ; Grade 1, inflammation légère présente dans la muqueuse, composée principalement de cellules mononucléaires, avec peu de lésions épithéliales ; Inflammation multifocale de grade 2 dépassant un score de grade 1, avec des cellules mononucléaires et quelques cellules polymorphonucléaires (neutrophiles), des glandes de la crypte éloignées de la membrane basale, une déplétion de la mucine des cellules caliciformes et l'épithélium occasionnellement éloigné de la muqueuse dans la lumière ; Grade 3, inflammation multifocale dépassant un score de grade 2, y compris les cellules mononucléaires et les neutrophiles progressant dans la sous-muqueuse, les abcès de la crypte présents avec une déplétion accrue de la mucine et la présence d'une rupture épithéliale ; Grade 4, absence de cryptes, inflammation sévère des muqueuses principalement composées de neutrophiles, et épithélium absent ou complètement détaché. Pour chaque souris, la moyenne de trois champs de vision a été examinée par échantillon d'intestin grêle. Tous les évaluateurs ont été aveuglés aux informations expérimentales actuelles.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Les coupes de tissus préparées ont été déparaffinées dans du xylène pendant 10 min, réhydratées dans de l'éthanol (100, 90, 80, 70 et 50 %) pendant 3 min chacune, puis placées dans de l'eau distillée pendant 10 min. La solution AB 8GX (1 % [p/v] bleu alcian 8GX, Biosesang, Séoul, Corée) a été appliquée sur les coupes pendant 30 min à 25 °C, suivie d'un lavage de 2 min sous l'eau courante du robinet. La contre-coloration a été effectuée pendant 5 min avec 0,1 % (p/v) de Fast Red nucléaire, suivie d'un lavage pendant 2 min sous l'eau courante du robinet. Par la suite, les coupes colorées ont été déshydratées dans deux changements d'éthanol à 95 % et deux changements d'alcool absolu. Les sections séchées ont été nettoyées à l'aide de xylène pendant quelques minutes, puis montées à l'aide d'un support synthétique (Thermo Fisher Scientific, Séoul, Corée).

La coloration de Gram a été réalisée comme suit45 : les coupes de tissus ont été déparaffinées dans du xylène, réhydratées dans de l'éthanol, incubées dans dH2O pendant 5 min, colorées pendant 1 min avec du cristal violet, puis lavées à l'eau du robinet. Les lames ont ensuite été colorées avec de l'iode de Gram pendant 1 min, rincées à l'eau du robinet, trempées dans de l'alcool éthylique à 95 % pendant 5 à 10 s, puis rincées à nouveau sous l'eau du robinet. Les lames ont été à nouveau colorées pendant 1 à 2 minutes dans de la safranine et rincées sous l'eau du robinet. Les coupes colorées ont été rapidement déshydratées dans deux changements d'éthanol à 95 %, suivis de deux changements d'alcool absolu, nettoyés dans du xylène et montés dans un support synthétique (Thermo Fisher Scientific, Corée). Les taches de safranine ont décoloré les cellules gram-négatives en rouge/rose, tandis que les bactéries gram-positives sont restées bleues.

La détection in situ à l'aide de sondes pour l'ARNr 16S a été réalisée comme suit : les tissus ont été déparaffinés avec du xylène et réhydratés à travers un gradient d'éthanol à l'eau. Les coupes ont été incubées avec une sonde bactérienne universelle marquée au Cy3 dirigée contre le gène de l'ARNr 16 S (5′-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′) à 50 ° C pendant la nuit et contre-colorées avec du DAPI pour la coloration nucléaire.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68. Le niveau de créatinine a été mesuré à l'aide du kit de détection de sérum de créatinine (KB02-H2, Arbor Assays, MI, USA) conformément aux instructions du fabricant. En bref, des souris ont été anesthésiées avec 30 µL d'isoflurane (Hana Pharm Co., Séoul, Corée) et le sang a été prélevé en effectuant une ponction du sinus rétro-orbitaire dans un tube de 1,5 mL contenant 10 µL d'EDTA 0,5 M, qui a ensuite été centrifugé. à 1000 × g pendant 15 min pour séparer le plasma, suivi d'un stockage à -80 ° C. Avant d'effectuer le test, tous les échantillons ont été centrifugés à 18 341 × g pendant 15 min. Ensuite, des solutions standard (25 μL) avec des concentrations connues de stock de créatinine, des échantillons de sang ou de l'eau (blanc) diluées avec 25 μL de diluant de test ont été mélangées avec 100 μL de réactif DetectX Creatinine dans une microplaque à 96 puits et incubées pendant 30 min. . La densité optique a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 490 nm. Le BUN a été mesuré à l'aide d'un kit de détection colorimétrique à l'azote uréique (KB024-H1, Arbor Assays) conformément aux instructions du fabricant. En bref, le plasma obtenu a été centrifugé à 18 341 × g pendant 10 min et dilué dans de l'eau distillée (1:20). Ensuite, 50 µL d'échantillons ou d'étalons appropriés ont été pipetés dans une plaque à 96 puits en double. Ensuite, 75 µL de réactifs colorés A et B ont été ajoutés à chaque puits à l'aide d'une pipette à répétition. La plaque a été incubée à 25 °C pendant 30 minutes et la densité optique a été mesurée à 450 nm.

En bref, des échantillons de rein ont été lysés dans 1 ml de tampon de lyse modifié (dodécylsulfate de sodium à 1 % [p/v] [SDS], orthovanadate de sodium à 1,0 mM et Tris à 10 mM ; pH 7,4) contenant des billes d'acier inoxydable (5 mm) et homogénéisé pendant 3 min à l'aide d'un TissueLyser II (Qiagen). Les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 13 475 × g pendant 10 min à 4 ° C et quantifiés à l'aide d'un kit de dosage des protéines BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Des quantités égales de protéines (30 μg) ont été séparées par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide (8 % de gel pour l'anti-PARP 1/2, 15 % de gel pour l'anti-caspase-3 clivée) dans un système d'électrophorèse sur gel Bio-Rad mini (Bio -Rad, Hercules, Californie, États-Unis). Les protéines ont été transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (0, 45 μm; EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) puis bloquées avec du lait écrémé à 5% dans une solution saline tamponnée au Tris plus 0, 1% de Tween (TBST) pendant 1 h. Ensuite, les membranes ont été incubées avec l'anticorps primaire souhaité pendant une nuit à 4°C. Après avoir lavé trois fois avec du TBST, les transferts ont été incubés avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 2 h, puis lavés avec du TBST trois fois pendant 30 min. La liaison d'anticorps a été détectée à l'aide d'un substrat de chimiluminescence amélioré (ELPIS Biotech, Daejeon, Corée). Les anticorps suivants ont été utilisés pour le Western Blot : anti-β-actine monoclonal de souris (1:1000; SC4778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-PARP1/2 polyclonal de lapin (1:1000; SC7150, Santa Cruz Biotechnology ) et anti-Gdf15 polyclonal de lapin (Abclonal, Woburn, MA, USA). Les anticorps secondaires utilisés étaient des IgG anti-lapin de chèvre conjugués à la HRP, des anticorps polyclonaux (ADI-SAB-300-J, Enzo Biochem Inc. Farmingdale, NY, USA) et des IgG anti-souris de chèvre (BML-SA204, Enzo Biochem Inc. .Farmingdale, NY, États-Unis).

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Les tissus congelés ont été homogénéisés dans 1 ml de solution RiboEx (GeneAll Biotechnology, Séoul, Corée) contenant des billes en acier inoxydable (5 mm) pendant 3 à 6 min à l'aide d'un TissueLyser II (Qiagen). L'ARN total a été extrait à l'aide de RiboEx (GeneAll Biotech, Séoul, Corée du Sud), conformément aux instructions du fabricant. Par la suite, l'ARN (500 ng) de chaque échantillon a été transcrit en ADNc à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc TOPscript RT DryMIX (Enzynomics, Daejeon, Corée). L'ADNc a été amplifié à l'aide de l'ADN polymérase N-Taq (Enzynomics) dans un MyCycler Thermal Cycler (Bio-Rad) en utilisant les paramètres suivants : dénaturation à 95 °C pendant 5 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, recuit à 60 °C pendant 15 s et allongement à 72 °C pendant 30 s. Les amorces suivantes ont été utilisées pour la PCR : GAPDH humaine, 5'-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TT-3' et 5'-CTG TGG TCA TGA GTC CTT CC-3' ; MUCIN2 humaine, 5'-TTA CCC ACT GCG TGG AAG AC-3' et 5'-GCA TTC CCG TGA ACA CAC AC-3'; MUCIN4 humaine, 5'-GAC GAC TTC AGG ATG CCC AA-3' et 5'-AGG GCC AGG GTG TCA TAG AT-3'; Gdf15 humain, 5'-ACG CTA CGA GGA CCT GCT AA-3' et 5'-AGA TTC TGC CAG CAG TTG GT-3'; GABARAPL1 humain, 5'-AGG AGG ACC ATC CCT TTG AGT A-3' et 5'-TCC TCA GGT CTC AGG TGG ATT-3'; PPARy humain, 5'- TTC AGA AAT GCC TTG CAG TG-3' et 5'- CAC CTC TTT GCT CTG CTC CT-3'. Une aliquote de chaque produit de réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été soumise à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2 % (p/v) et a été visualisée par coloration avec du bromure d'éthidium. Pour la PCR en temps réel, l'ADNc a été amplifié à l'aide de SYBR green (SG, TOPreal™ qPCR 2X PreMIX, Enzynomics), réalisé avec Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Allemagne) en utilisant les paramètres suivants : dénaturation à 94 °C pendant 2 min , suivi de 40 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 10 s, recuit à 59 °C pendant 30 s et élongation à 98 °C pendant 45 s. Chaque échantillon a été évalué en triple pour assurer la robustesse statistique. La quantification relative de l'expression génique a été réalisée à l'aide de la méthode Ct comparative, dans laquelle la valeur Ct a été définie comme le point auquel une augmentation statistiquement significative de la fluorescence a été observée. Le nombre de cycles de PCR (Ct) requis pour que les intensités de fluorescence dépassent une valeur seuil immédiatement au-dessus du niveau de fond a été calculé pour les réactions de test et de référence. GAPDH a été utilisé comme contrôle interne pour toutes les expériences.

Les cellules transfectées avec pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT (un cadeau de Robin Ketteler, plasmide Addgene # 123230, Watertown, MA, USA) ont été exposées à différents traitements. Les cellules ont été lavées avec du PBS, puis les lamelles ont été soigneusement placées et une légère pression a été appliquée pour éliminer les bulles restantes. Les images confocales ont été obtenues avec un microscope confocal Andor BC43 Benchtop (Andor, Belfast, Royaume-Uni) à l'excitation monoligne (529 nm pour GFP ou 600 nm pour mCherry). Les images ont été acquises avec le logiciel Fusion (Andor) et traitées avec le logiciel Imaris (Andor).

L'analyse du réseau PPI a été réalisée à l'aide des outils de recherche pour la récupération des gènes en interaction (STRING) (https://string-db.org/) et des bases de données ARN, qui couvrent divers composants liés à la machinerie de l'autophagie fondés sur des preuves, leurs régulateurs, la transcription facteurs, régulateurs de miARN et connecteurs de réseau de signalisation dans une illustration multicouche40. La centralité intermédiaire du nœud x a été calculée à l'aide de la fonction g(x).

où \({{{{{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\) est le nombre total de chemins les plus courts du nœud s au nœud t, et \({{{{ {{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\left(x\right)\) est le nombre de chemins qui passent par le nœud x (pas où x est un point de terminaison).

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Des souris de type sauvage et Gdf15 KO âgées de huit semaines ont été traitées avec du véhicule ou du CP (20 mg / kg, par voie intrapéritonéale) pendant 72 h ( n = 4 - 5). Des échantillons fécaux (5 - 6 pièces; 100 mg) ont été prélevés avant le sacrifice animal. Les échantillons de selles collectés ont été stockés à -150 ° C avant l'extraction de l'ADN. L'ADN microbien a été extrait et purifié à partir de 100 mg de l'échantillon fécal à l'aide du mini kit Exgene Stool DNA (GeneALL, Séoul, Corée), conformément aux instructions du fabricant. L'ADN extrait a été quantifié à l'aide d'un fluoromètre Qubit et d'un kit de réactifs dsDNA haute sensibilité (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Treize échantillons d'ADN ont été regroupés en tant que groupes de traitement pour la préparation de la bibliothèque métagénomique 16S. La région V3–V4 du gène de l'ARNr 16S a été amplifiée par PCR avec un jeu d'amorces (341 F, 5′-CCTACGGGNGCWGCAG-3′; 805 R, 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′) et des adaptateurs de séquençage Illumina (Illumina Inc. ) en utilisant le KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA Biosystems, Wilmington, WA, USA) dans les conditions de cyclage suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit à 55 °C pendant 30 s, extension à 72 °C pendant 30 s et une extension finale à 72 °C pendant 5 min. Après purification des amplicons à l'aide de billes AMPure® XP (Agencourt Biosciences, Beverly, MA, USA), les produits de PCR ont été vérifiés pour la taille de la bibliothèque à l'aide d'un BioAnalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), et la quantité a été mesurée à l'aide d'un Qubit fluoromètre. L'amplicon de PCR a ensuite été soumis à une PCR d'indexation à l'aide du kit d'indexation Nextera XT (Illumina, Inc.). Les conditions de cycle de PCR étaient les suivantes : 95 °C pendant 3 min, suivi de huit cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, annelage à 55 °C pendant 30 s, extension à 72 °C pendant 30 s, et une finale extension à 72 °C pendant 5 min. Les amplicons PCR indexés ont été purifiés à l'aide de billes AMPure® XP, vérifiés pour la taille à l'aide d'un bioanalyseur et quantifiés à l'aide d'un fluorimètre Qubit. Les amplicons quantifiés ont été dilués à 4 nM et regroupés pour le séquençage sur une plate-forme Illumina iSeq (Illumina, Inc.), ciblant 2 lectures de séquences appariées de 150 pb.

La procédure était basée sur la méthode précédemment publiée68,69. Toutes les séquences ont été filtrées par qualité et les amorces ont été coupées à l'aide de Trimmomatic (v0.39)73 avec les paramètres suivants : LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36 SLIDINGWINDOW:4:15. Les paires de lecture qui ont passé le filtre de qualité ont été analysées plus en détail à l'aide du pipeline Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2, v2020.2)74. Trente-quatre bases des lectures inversées ont été tronquées pour l'amélioration de la qualité à l'aide de l'algorithme DADA275. Les paires de lecture ont ensuite été jointes, débruitées et dérépliquées, et les chimères ont été supprimées. Des données détaillées ont été utilisées pour désigner les ASV. Des séquences d'ARNr 16 S représentatives ont été attribuées à des groupes taxonomiques à l'aide du classificateur Bayes naïf QIIME2, entraînées sur 99 % d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) et la région d'amorce de la base de données d'ARNr SILVA (v138)76. La classification taxonomique a été visualisée à l'aide du plug-in QIIME2 taxon barplot. Des séquences d'ARNr 16S représentatives ont été soumises à un alignement multiséquence masqué à l'aide de MAFFT77,78. Un arbre phylogénétique a été construit à l'aide de FastTree79. Une carte thermique représentant le pourcentage d'abondance d'OTU, dont l'abondance relative se situait dans le top 30 dans n'importe quel échantillon, a été générée à l'aide du package R QIIME2R (v0.99.22). Un arbre phylogénétique basé sur les OTU abondantes a été construit et visualisé à l'aide de l'algorithme de jonction de voisins avec correction de Jukes-Cantor à l'aide de MEGA X80. L'ensemble de données de séquence d'ARNr 16 S a été analysé plus en détail à l'aide de PICRUSt2 pour prédire les fonctions associées au métagénome, telles que les enzymes et les voies liées au métabolisme de la mucine.

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Le test t de Student a été utilisé pour l'analyse comparative de deux groupes de données. Pour comparer plusieurs groupes, les données ont été soumises à une analyse de variance (ANOVA) avec la méthode Newman-Keuls effectuée comme une évaluation ANOVA posthoc. L'analyse de corrélation de Pearson a été effectuée pour déterminer le coefficient de corrélation (R) des ensembles de données cliniques. Toutes les évaluations sont représentatives de deux ou trois expériences indépendantes. Les détails du nombre de répétitions biologiques et d'essais sont fournis dans les légendes des figures.

Cette étude animale a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université nationale de Pusan ​​(PNU-IACUC, Busan, Corée) (PNU-2019-2365) et a été réalisée dans le cadre de la Déclaration d'Helsinki et du Guide pour le soin et l'utilisation des Animaux de laboratoire tel qu'adopté et promulgué par les National Institutes of Health des États-Unis.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies dans les données supplémentaires. Les données sont disponibles sur demande auprès des auteurs. Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Certaines données peuvent ne pas être disponibles pour des raisons de confidentialité ou de restrictions éthiques. Les transferts Western non recadrés peuvent être trouvés dans la figure supplémentaire s5.

N'est pas applicable.

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Nous apprécions grandement l'assistance expérimentale pour le traitement des animaux fournie par Kyung Hee Pyo (Université nationale de Pusan, Yangsan, Corée). Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche scientifique fondamentale par l'intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF), financé par le ministère de l'Éducation (2018R1D1A3B05041889), et le cadre du programme de coopération internationale géré par la National Research Foundation of Korea (NRF-2022K2A9A1A01098067 , exercice 2022). Le travail de TK a été soutenu par le programme stratégique UKRI BBSRC Gut Microbes and Health Institute BB/R012490/1 et ses projets constitutifs BBS/E/F/000PR10353 et BBS/E/F/000PR10355. ainsi qu'une subvention du programme stratégique de base UKRI BBSRC pour les génomes à la sécurité alimentaire (BB/CSP1720/1) et ses modules de travail constitutifs, BBS/E/T/000PR9819 et BBS/E/T/000PR9817.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Navin Ray, Seung Jun Park, Hoyung Jung.

Laboratoire d'exposome muqueux et de biomodulation, Département des sciences biomédicales intégratives, Université nationale de Pusan, Yangsan, Corée

Navin Ray, Seung Jun Park, Hoyung Jung, Juil Kim et Yuseok Moon

Division des maladies digestives, Faculté de médecine, Imperial College London, Londres, Royaume-Uni

Tamas Korcsmaros

Institut Earlham, Norwich Research Park, Norwich, Royaume-Uni

Tamas Korcsmaros et Yuseok Moon

Quadram Institute Bioscience, Norwich Research Park, Norwich, Royaume-Uni

Tamas Korcsmaros

Programme d'études supérieures en sciences des données génomiques, Université nationale de Pusan, Yangsan, Corée

Lune Yuseok

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YM a défini la conception du projet et les hypothèses. NR, SJP et JK ont mené les expériences et analysé les données. HJ a analysé les données du microbiome. TK a soutenu l'analyse du réseau de l'ARN. YM a préparé le manuscrit et supervisé le projet.

Correspondance avec Yuseok Moon.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Stefan Reuter et l'autre examinateur, anonyme, pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Joao Valente. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Ray, N., Park, SJ, Jung, H. et al. Gdf15 sensible au stress neutralise la toxicité réno-intestinale via la reprogrammation autophagique et microbiote. Commun Biol 6, 602 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1

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Reçu : 26 septembre 2022

Accepté : 22 mai 2023

Publié: 03 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1

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