De nouvelles approches pour développer des biomarqueurs de l'utilisation de contraceptifs hormonaux

May 20, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 245 (2023) Citer cet article

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Pour identifier les biomarqueurs de l'utilisation de contraceptifs hormonaux (HC) dans l'urine et la salive, nous avons mené une étude pilote auprès de 30 femmes initiant du lévonorgestrel (LNG) contenant des contraceptifs oraux combinés (COC) ou de l'acétate de médroxyprogestérone retard (DMPA) (15/groupe). Sur la base de la pharmacocinétique établie des COC, nous avons prélevé des échantillons de sérum et d'urine avant l'ingestion de COC et pendant les jours un et trois d'utilisation, ou avant l'injection de DMPA et les jours 21 et 60 après l'injection. Nous avons utilisé la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour mesurer le LNG sérique/urine et le MPA. Le LNG était indétectable au départ (spécificité 100 %) ; après l'ingestion, la plupart des échantillons d'urine présentaient des niveaux de LNG détectables (sensibilité : 80 % 6 h après la première dose, 93 % 6 h après la troisième dose). Nous avons utilisé un kit d'immunoessai DetectX LNG et avons montré une sensibilité de 100% en mesurant le LNG urinaire. Les taux urinaires de MPA étaient indétectables chez 14/15 femmes au départ (spécificité 91 %) ; après l'injection, tous les échantillons d'urine présentaient des niveaux de MPA détectables (sensibilité : 100 % aux jours 21 et 60). Les résultats suggèrent que l'échantillonnage d'urine peut être utilisé pour identifier un biomarqueur de l'utilisation du GNL et du MPA. Sur la base des preuves d'autres études hormonales stéroïdiennes montrant des changements affectant le profil du transcriptome de la salive à 24 h, nous avons utilisé les mêmes points de temps (COC, DMPA) pour collecter la salive. Nous avons effectué une analyse du transcriptome et détecté plusieurs gènes exprimés de manière différentielle dans la salive des utilisateurs de DMPA aux jours 21 et 60 par rapport à la ligne de base ; aucun parmi les utilisateurs de COC. Nous prévoyons d'autres recherches sur l'expression différentielle des gènes dans la salive en tant que biomarqueur HC de l'utilisation du DMPA, et nous explorerons de plus longues périodes d'utilisation des COC et des temps de collecte de la salive, ainsi que l'application du séquençage des microARN pour soutenir l'utilisation de la salive comme biomarqueur des COC.

Des données précises sur l'utilisation des contraceptifs ont des implications pour l'établissement d'objectifs de santé publique, la prestation de soins cliniques et la conduite de recherches cliniques. Dans le domaine de la santé publique, les statistiques sur les taux de prévalence contraceptive (TPC) affectent la planification pour atteindre des objectifs nationaux et internationaux réalistes pour les services de santé sexuelle et reproductive1,2,3. L'exactitude des données de RCP est particulièrement importante dans les régions où les taux de grossesse restent élevés malgré les rapports faisant état de taux élevés d'utilisation de contraceptifs. Par conséquent, la prestation de services de soins cliniques obstétricaux et néonatals peut ne pas être proportionnée aux besoins locaux, régionaux ou nationaux4,5,6. L'accès aux informations sur l'utilisation des contraceptifs peut également faciliter la prise de décision partagée entre les cliniciens et les clients concernant la sélection d'une méthode contraceptive la mieux adaptée pour atteindre les objectifs individuels de planification familiale7. En ce qui concerne les essais cliniques, les données obtenues auprès des volontaires sur leur utilisation d'une méthode constituent la base de l'analyse et de la communication des résultats d'innocuité, d'efficacité et d'acceptabilité et sont fondamentales pour les examens réglementaires et les décisions concernant l'approbation de nouvelles méthodes8.

Compte tenu de l'importance globale des informations sur l'utilisation des contraceptifs, de nombreux enquêteurs ont réfléchi aux défis actuels associés à l'obtention de données précises basées sur l'auto-déclaration7,8,9,10,11,12,13. Récemment, plusieurs chercheurs ont décrit des résultats plus encourageants dans l'obtention de données précises, mais recommandent l'utilisation de mesures objectives pour valider l'utilisation de contraceptifs autodéclarés14,15. La mesure des niveaux de concentration sérique des progestatifs synthétiques (le composant actif des contraceptifs hormonaux) dans les échantillons est considérée comme la « norme de référence »16 pour évaluer l'utilisation des contraceptifs hormonaux (HC). Cependant, de tels tests nécessitent des ponctions veineuses invasives, reposent sur des laboratoires dotés d'une capacité spécifique pour évaluer les concentrations hormonales exogènes et ne sont pas pratiques pour une utilisation dans les enquêtes auprès des ménages ou les essais cliniques de stade avancé avec des milliers de participants. Des approches expérimentales pour mesurer les niveaux d'hormones dans l'urine sont en cours de développement, bien qu'elles aient tendance à s'appuyer sur l'échantillonnage de progestérone et d'œstrogènes endogènes (comme l'estradiol) dans le contexte des soins cliniques17. Comme cela a été bien décrit, les hormones stéroïdes endogènes et synthétiques sont principalement métabolisées dans le foie et sont partiellement excrétées sous forme de métabolites conjugués et d'hormones intactes dans l'urine. Nous avions prévu que nous pourrions utiliser des méthodes bien décrites et très sensibles pour mesurer ces hormones ou leurs métabolites dans des échantillons d'urine en tant que marqueurs de l'utilisation hormonale17,18,19,20. Plus précisément, nous avons émis l'hypothèse que nous pourrions utiliser des méthodes validées de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour mesurer les niveaux de GNL et de MPA dans les échantillons de sang et d'urine, ainsi que le kit d'immunodosage enzymatique LNG très sensible (DetectX ; Arbor Assays, MI, USA) pour mesurer le LNG immunoréactif dans l'urine. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si l'urine, qui peut être collectée plus facilement et à moindre coût que le sérum, pouvait être utilisée comme biomarqueur objectif des contraceptifs couramment utilisés formulés avec des progestatifs, tels que le lévonorgestrel (LNG), présent dans de nombreux contraceptifs oraux combinés. (COC) ou l'acétate de médroxyprogestérone (MPA) utilisé dans les formulations injectables, par exemple l'acétate de médroxyprogestérone retard (DMPA).

Nous avons également envisagé la possibilité d'utiliser la salive pour identifier des biomarqueurs, car ce liquide corporel n'est pas simplement un ultrafiltrat plasmatique, mais contient également une bibliothèque complète de protéines, d'hormones, d'anticorps et d'autres composés moléculaires. C'est une matrice idéale pour l'application de la transcriptomique pour analyser l'expression différentielle des gènes21. Nous avons émis l'hypothèse que les hormones stéroïdes synthétiques telles que le LNG et le MPA pénètrent dans la salive par diffusion passive. Cependant, leurs concentrations attendues sont faibles par rapport au sang et ne peuvent pas être mesurées de manière fiable à l'aide de méthodes telles que l'ELISA qui sont couramment appliquées aux échantillons de sérum et d'urine. Nous avons également considéré qu'avec l'utilisation de contraceptifs hormonaux, le profil du transcriptome serait modifié dans la salive et que de tels changements pourraient servir de biomarqueur potentiel de l'exposition à la contraception. Nous avons émis l'hypothèse que nous pourrions utiliser le séquençage de l'ARN pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) dans des échantillons de salive provenant d'individus utilisant la contraception hormonale22,23,24,25.

En conséquence, nous avons mené une étude pilote transversale et ouverte pour déterminer si nous pouvions utiliser des tests validés pour mesurer les hormones ou leurs métabolites dans les échantillons d'urine obtenus auprès de personnes utilisant des COC ou du DMPA. Nous avons également exploré la possibilité d'utiliser le séquençage de l'ARN avec des échantillons de salive pour détecter des gènes exprimés de manière différentielle comme marqueur de l'utilisation de contraceptifs hormonaux.

L'étude a été approuvée par le Comité d'examen institutionnel du Conseil de la population, le Comité d'éthique de Profamilia (site d'étude) en République dominicaine et CONABIOS, l'agence nationale de recherche médicale de la République dominicaine. Chaque participant a fourni un consentement éclairé écrit avant de se soumettre à toute procédure de dépistage. L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki, aux directives de bonnes pratiques cliniques de la Conférence internationale sur l'harmonisation et au Code of Federal Regulations des États-Unis relatif aux études cliniques.

Nous avons recruté des femmes intéressées à commencer le DMPA ou les COC pour la durée de l'étude et avons inscrit deux groupes (15 par groupe). Les personnes du groupe A ont utilisé un COC contenant de l'éthinylestradiol et du LNG (EE : 30 mcg et LNG 150 mcg Microgynon-Bayer, Allemagne) et celles du groupe B ont utilisé du DMPA 150 mg (Pfizer Manufacturing Belgium NV, Belgique) administré par voie intramusculaire. Les adultes en bonne santé, non enceintes et non allaitantes (18 à 39 ans) n'utilisant pas actuellement le DMPA et capables de fournir un consentement éclairé écrit étaient éligibles. Nous avons exclu les participantes potentielles si elles étaient inscrites à une autre étude portant sur des produits contraceptifs actuellement ou dans les 2 mois précédant le dépistage, présentaient des contre-indications à l'utilisation des contraceptifs sélectionnés, présentaient des saignements vaginaux (sans compter les saignotements entre les règles), étaient testées positives pour Infection par le VIH ou l'hépatite B lors du dépistage, ou ayant utilisé le DMPA au cours des 12 derniers mois. Une liste complète des critères d'inclusion/exclusion est présentée dans le tableau supplémentaire 1S.

Tous les participants ont eu trois visites après le dépistage ; le délai de collecte des échantillons de sérum, d'urine et de salive variait selon le groupe/la méthode de contraception (tableau 1). Les participants du groupe A ont pris leurs première, deuxième et troisième pilules sur le site de l'étude. Le sérum, l'urine et la salive ont été prélevés avant de recevoir leur première dose et à des intervalles désignés les jours 1 et 3. Les participants du groupe B ont subi un prélèvement de sérum, d'urine et de salive avant de recevoir leur première injection de DMPA le jour 1, puis à nouveau aux jours 21 et 60 (± 4 jours). Le personnel du site a surveillé les participants pour détecter la survenue d'événements indésirables (EI) et d'événements indésirables graves (EIG) tout au long de l'étude. Les données des participants ont été anonymisées dans tous les documents de l'étude, les échantillons, les analyses et les calculs ultérieurs.

Nous avons sélectionné des points temporels pour le prélèvement d'échantillons d'urine et de sérum chez les utilisatrices de COC sur la base de la pharmacocinétique (PK) établie des COC qui impliquent des concentrations quotidiennes maximales et minimales de progestatif et sont les mêmes pour chaque période de 24 heures pendant les jours du cycle où la pilule est prise. prises pour supprimer l'ovulation26. La concentration sérique maximale de LNG administré par voie orale est généralement d'environ une à deux heures après l'ingestion, et ses métabolites ainsi que de petites quantités de LNG non métabolisé apparaissent dans l'urine environ quatre à huit heures après l'ingestion. Par conséquent, nous avons sélectionné un point de temps de six heures pour collecter à la fois le sérum et l'urine après l'ingestion de COC et avons sélectionné les jours 1 et 3 pour collecter des échantillons (tableau 1).

Nous avons également utilisé des données pharmacocinétiques établies pour sélectionner les moments de collecte de sérum et d'urine pour les utilisateurs de DMPA27. Le MPA est libéré lentement du site d'injection du DMPA dans le sang et les niveaux sont maintenus pour obtenir la suppression de l'ovulation (efficacité) pendant au moins trois mois. De petites quantités de MPA non métabolisé et de ses métabolites apparaissent dans l'urine à l'état d'équilibre à partir du jour 3 après l'injection et peuvent être mesurées de manière fiable tout au long de la période prolongée de traitement. La concentration maximale de MPA se trouve généralement dans le sérum environ trois semaines après l'injection et les niveaux sont maintenus pour atteindre l'efficacité pendant au moins trois mois. Par conséquent, nous avons collecté le sérum des utilisateurs de DMPA au jour 21 et sélectionné le jour 60 pour la deuxième collecte (tableau 1).

En ce qui concerne la salive, l'objectif était d'identifier l'impact sur le profil transcriptome de la salive en réponse à l'utilisation et à la concentration de LNG et de MPA dans le sérum. Étant donné que la salive est un bon indicateur des taux plasmatiques de diverses substances telles que les hormones et les produits pharmaceutiques et que l'ARNm salivaire sert de signature chimique indiquant qu'un gène particulier a été exprimé21, nous avons supposé que nous pouvions utiliser les mêmes points temporels que nous avons sélectionnés pour la collecte de sérum et l'urine pour recueillir la salive (tableau 1). En sélectionnant ces mêmes moments, nous avons également été influencés par les résultats d'études portant sur d'autres hormones stéroïdiennes. Avec la testostérone, par exemple, les chercheurs ont identifié une augmentation significative de la testostérone (niveaux) dans la salive, le sang et l'urine lorsqu'elle est administrée par voie transdermique28.

Sérum Un phlébotomiste a prélevé 10 mL de sang par participant qui a été traité pour le sérum, immédiatement congelé et stocké à – 20 °C jusqu'à ce qu'il soit expédié sur de la neige carbonique au Population Council de New York pour analyse.

Urine Nous avons fourni aux participants des récipients d'échantillonnage pour recueillir 20 à 30 ml d'urine à des moments précis. Ceux-ci ont été conservés à – 20 °C jusqu'à leur expédition.

Le personnel du site de salive a demandé aux participants de s'abstenir de manger, de boire, de fumer ou de suivre des procédures d'hygiène buccale pendant au moins une heure avant l'échantillonnage et de cracher de la salive dans un tube à essai gradué pendant 5 minutes pour recueillir environ 5 ml de salive. Pour inhiber la dégradation de l'ARN, le personnel du site a conservé les tubes de prélèvement sur de la glace avant de prélever la salive. Conformément aux instructions du fournisseur (Norgen Biotek, Californie, États-Unis), le personnel du site a ajouté un conservateur de 2 mL contenant un réactif stabilisant immédiatement après le prélèvement et a stocké les tubes de prélèvement à -80 °C en vue de leur expédition.

Avant de mesurer les niveaux d'hormones dans les échantillons de l'étude, nous avons utilisé notre protocole standard conforme aux directives de la FDA pour valider nos méthodes LCMS pour mesurer le LNG et le MPA dans le sérum et l'urine. Plus précisément, nous avons dopé six niveaux de concentration d'étalons d'étalonnage (STD) dans la plage comprise entre 0,1 et 10 ng/mL dans le sérum humain et préparé séparément trois niveaux d'échantillons de contrôle qualité (QC) à des concentrations de 0,3, 1 et 7 ng/mL. Nous avons utilisé respectivement LNG-d6 ou MPA-d6 (5 ng/ml) comme standards internes (IS) et évalué et validé les paramètres suivants : spécificité, linéarité, limite de quantification, exactitude, précision, effets de matrice, récupération et stabilité . Nos résultats ont montré que nous respections les critères d'acceptation de tous les paramètres de validation selon le protocole.

Pour l'étape suivante, nous avons mesuré les niveaux de LNG et de MPA dans les échantillons de sérum et d'urine par LC-MS/MS en utilisant respectivement le LNG-d6 ou le MPA-d6 comme étalons internes. Pour purifier le LNG ou le MPA à partir d'échantillons de test de sérum, nous avons utilisé la méthode de précipitation des protéines. Plus précisément, nous avons ajouté 100 µl de méthanol à 100 µl de l'échantillon d'essai contenant l'IS (5 ng/ml). Nous avons vortexé les échantillons pendant 15 minutes (centrifugés à 14,5 × 103 tr/min pendant 10 minutes) et transféré les surnageants dans des flacons de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour injection. De plus, nous avons traité les étalons de GNL ou de MPA et les échantillons de contrôle qualité qui ont été dopés avec IS en utilisant la même méthode de précipitation des protéines.

Pour purifier le GNL ou le MPA à partir d'échantillons d'urine, nous avons effectué une extraction en phase solide à l'aide de cartouches Oasis HLB Plus Light (Waters Corporation, Milford, MA). Nous avons élué le GNL ou le MPA de la cartouche en utilisant 1 ml de méthanol et séché chaque échantillon sous azote gazeux. Nous avons reconstitué le LNG/MPA purifié avec 150 µl de phase mobile A/B (50/50, v/v) et injecté des aliquotes de 10 µl dans l'assemblage de l'auto-injecteur. De plus, nous avons traité des étalons de GNL ou de MPA, des échantillons de contrôle de qualité dopés avec de l'IS et 1 ml d'urine humaine vierge en utilisant la même méthode d'extraction en phase solide. Nous avons utilisé la colonne Waters Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 × 50 mm) pour séparer le GNL ou le MPA des autres composants par élution en gradient en utilisant la phase mobile de 80 % A (formiate d'ammonium 2 mM + 0,1 % formique acétique dans 10 % de méthanol ) et 20 % B (100 % méthanol) jusqu'à 6 minutes à 90 % B avec un débit de 0,3 ml/min. Nous avons ensuite utilisé Waters TQ-s pour surveiller les transitions des ions produits de 313,35 m/z à 245,28 m/z pour le GNL et de 319,38 à 251,32 m/z pour le LNG-d6 IS. De même, nous avons surveillé les transitions 387,42 m/z à 327,35 m/z pour MPA, et 393,40 m/z à 330,34 m/z pour MPA-d6 IS. Nous avons utilisé la version 4.2 du logiciel MassLynx pour contrôler tous les paramètres du système LC-MS/MS.

Lors de l'analyse des échantillons d'étude, nous avons inclus six niveaux d'étalons d'étalonnage, un double blanc, un blanc de matrice dopé avec un étalon interne et trois niveaux d'échantillons de contrôle qualité (n = 2). Nous avons placé un ensemble d'échantillons de contrôle qualité au début de la file d'attente d'échantillons et un autre ensemble à la fin de la file d'attente d'échantillons. Les étalons de calibration étaient injectés en tête et réinjectés en fin de file d'échantillons. La limite inférieure de quantification (LLOQ) pour le LNG et le MPA sériques était de 0,1 ng/ml et pour le LNG et le MPA urinaires était de 25 pg/ml. 50 µl de l'échantillon de sérum ont été utilisés pour le LNG ou le MPA dans le dosage du sérum et un échantillon d'urine humaine de 1 ml a été utilisé pour le LNG ou le MPA dans le dosage de l'urine. Le coefficient de variation intra- et inter-essai était inférieur à 15 % sur la base des résultats des échantillons de contrôle qualité.

Nous avons utilisé un kit commercial DetectX LNG EIA (Arbor Assays, MI, USA) pour mesurer le GNL et les métabolites dans les échantillons de sérum et d'urine. Pour valider le test, nous avons d'abord mesuré les niveaux de LNG dans des échantillons de sérum et les avons comparés aux valeurs obtenues par LC-MS/MS. Ensuite, nous avons optimisé la mesure des niveaux de LNG dans les échantillons d'urine qui ont été purifiés par la même extraction en phase solide décrite pour les procédures de mesure LC-MS/MS. Nous avons reconstitué les résidus séchés avec un tampon de dosage et utilisé la procédure du kit de dosage immunologique pour mesurer les concentrations de LNG. Nous avons rapporté les valeurs de LNG urinaire en pg/mL ; la limite inférieure de détection était de 80 pg/ml.

Pour extraire l'ARN total de la salive de chaque participant, nous avons utilisé un tampon de lyse TRIzol®, puis nous avons purifié cet ARN à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN Nucleospin (Takara Bio, CA, USA, Inc). Nous avons mesuré les concentrations d'ARN à l'aide du fluoromètre Qubit (Life Technologies, MA, USA) et l'intégrité de l'ARN à l'aide du bioanalyseur (Agilent 4200 Tape Station). Nous avons effectué des préparations de bibliothèques d'ARN pour les réactions de séquençage. Nous avons ensuite marqué l'ARN et l'avons séquencé à l'aide du kit Total RNA-Seq. Nous avons utilisé le kit SMART-Seq v4 Ultra Low Input pour le séquençage pour la synthèse et l'amplification d'ADNc pleine longueur (Clontech, CA, USA) et la bibliothèque Illumina Nextera XT pour la préparation de la bibliothèque de séquençage. En bref, l'ADNc a été fragmenté et l'adaptateur a été ajouté à l'aide de Transposase, suivi d'une PCR à cycle limité pour enrichir et ajouter un index aux fragments d'ADNc. La bibliothèque finale a été évaluée avec Agilent TapeStation. Les échantillons ont été séquencés en utilisant une configuration 2 × 150 Paired-End (PE). Utilisation des services de GENEWIZ, LLC. (South Plainfield, NJ, États-Unis), nous avons effectué l'analyse bioinformatique et appliqué le logiciel de contrôle HiSeq (HCS) pour effectuer l'analyse d'images et l'appel de base. Nous avons converti les données de séquence brutes (fichiers .bcl) générées à partir d'Illumina HiSeq en fichiers fastq et démultiplexées à l'aide du logiciel bcl2fastq 2.17 d'Illumina. Un mésappariement a été autorisé pour l'identification de la séquence d'index. Après démultiplexage, nous avons vérifié les données de séquence pour la qualité globale et le rendement. Ensuite, nous avons coupé les lectures de séquences pour supprimer les éventuelles séquences adaptatrices et les nucléotides de mauvaise qualité à l'aide de Trimmomatic v.0.36. Nous avons cartographié les lectures coupées sur le génome de référence Homo sapiens GRCh38 disponible sur ENSEMBL à l'aide de l'aligneur STAR v.2.5.2b qui utilise un aligneur épissé pour détecter les jonctions d'épissage et les incorporer pour aider à aligner l'ensemble des séquences de lecture, résultant en des fichiers BAM. Nous avons ensuite appliqué le progiciel Subread v.1.5.2, qui utilise le nombre de fonctionnalités pour calculer le nombre d'occurrences de gènes uniques. Nous n'avons compté que les lectures uniques qui se trouvaient dans les régions d'exons et avons utilisé le tableau du nombre de coups de gène pour analyser l'expression différentielle en aval.

Le critère d'évaluation principal de l'étude était la sensibilité et la spécificité de la détection du LNG ou du MPA dans l'urine. Nous avons calculé la sensibilité comme le nombre total d'échantillons d'urine avec du LNG ou du MPA détectable par LC-MS/MS divisé par le nombre d'échantillons de sérum avec du LNG ou du MPA détectable par point dans le temps. Nous avons calculé la spécificité comme le nombre d'échantillons d'urine avec du LNG ou du MPA indétectable divisé par le nombre d'échantillons de sérum avec du LNG ou du MPA indétectable par point dans le temps. Nous avons également calculé la sensibilité et la spécificité des mesures de LNG urinaire par EIA. Nous avons calculé des intervalles de confiance à 95 % sur la base de tests exacts autour de chaque estimation de sensibilité et de spécificité.

Comme critère d'évaluation exploratoire, nous avons recherché des preuves dans la salive de l'expression différentielle de gènes spécifiques après la prise de COC par des volontaires ou l'injection de MPA. Nous avons utilisé DESeq2 pour comparer l'expression génique au départ (pré-dose) avec les résultats à des intervalles post-dose à partir des échantillons de salive des utilisateurs de COC et de MPA. En appliquant le test de Wald, nous avons généré des valeurs p et des changements de pli Log2. Nous avons également identifié des gènes avec des valeurs p inférieures aux valeurs critiques ajustées Benjamini-Hochberg. Nous avons utilisé ces résultats pour ajuster les comparaisons multiples et pour maintenir un taux d'erreur global de type 1 inférieur à < 0,05 et des changements de facteur log2 absolus > 1 pour déterminer les DEG pour chaque comparaison. Nous avons ensuite généré des parcelles de volcan en utilisant les 500 meilleurs gènes, sélectionnés par le changement de pli Log2 et les valeurs p ajustées. Nous avons effectué une analyse ontologique des gènes sur l'ensemble statistiquement significatif de gènes via le logiciel GeneSCF v.1.1-p2. Nous avons utilisé la liste GO humaine d'annotation d'ontologie génique (GOA) pour regrouper l'ensemble de gènes en fonction de leurs processus biologiques et déterminer leur signification statistique. Nous avons généré une liste de gènes regroupés en fonction de leurs ontologies génétiques.

Entre août et novembre 2019, nous avons sélectionné 41 participants potentiels et en avons recruté 30, 15 par groupe (Fig. 1). Tous les participants étaient hispaniques, métis, pares et avaient un âge médian de 29,5 ans (tableau 2). Les 30 participants ont terminé l'étude en décembre 2019 sans EIG ni EI entraînant des interruptions précoces.

Diagramme de flux d'étude. Consort Diagram montrant que 41 participants potentiels ont été sélectionnés et 30 ont été inscrits, dont 15 par groupe (COC ou Depo).

Sensibilité/spécificité du LNG dans l'urine : dans les Fig. 2A et B, nous avons présenté les valeurs sériques et urinaires quantifiées pour les jours 1 et 3, respectivement. Le tableau 3 montre les résultats de sensibilité et de spécificité LC–MS/MS et EIA pour les mesures de LNG dans l'urine des utilisateurs de COC. Avec les deux méthodes, nous avons observé une spécificité de 100 %, aucun individu n'ayant de LNG détectable dans le sérum ou l'urine au départ (avant l'ingestion de COC). Après l'ingestion de COC, le LNG sérique était détectable pour tous les participants à tous les moments de collecte. La sensibilité du LNG urinaire par analyse LC-MS/MS au jour 1 était de 80 % six heures après la dose 1 et au jour 3 de 60 % 24 heures après la dose 2 et de 93 % six heures après la dose 3 ; la sensibilité avec l'EIA était de 100 % à tous les points dans le temps.

(A) Les concentrations de lévonorgestrel (LNG) mesurées par la méthode LCMS/MS dans des échantillons de sérum et d'urine ont été recueillies les jours 1 et 3 du traitement COC. Aucun individu n'a montré de LNG détectable dans le sérum ou l'urine au départ (pré), mais tous ont montré une augmentation 6 h après l'ingestion les deux jours (jours 1 et 3). Seuls huit des 15 participants avaient des niveaux détectables aux trois points de temps après la ligne de base. Six participants avaient des niveaux de LNG inférieurs au niveau de quantification au moment du creux (24 h après la dose 2), dont trois avaient également des niveaux indétectables 6 h après leur première dose. (B) Concentrations de lévonorgestrel (LNG) mesurées par la méthode EnzymeImmuno assay (EIA) dans des échantillons d'urine prélevés les jours 1 et 3 du traitement COC. Aucun individu n'a montré de LNG détectable dans le sérum ou l'urine au départ (pré) et a montré des niveaux détectables à tous les moments après l'ingestion les deux jours (jours 1 et 3). (C) Concentrations de médroxyprogestérone (MPA) mesurées par la méthode LC-MS/MS dans des échantillons de sérum et d'urine prélevés au jour 0 (référence) et 21 et 60 jours après l'injection de dépôt. Quatre personnes avaient du MPA détectable dans le sérum avant de recevoir leur injection, dont deux avaient également du MPA détectable dans l'urine. Les deux femmes avec un MPA urinaire indétectable mais un MPA sérique détectable avaient des niveaux inférieurs à ceux requis pour l'efficacité contraceptive (< 0,2 ng/mL). Un individu avec un MPA sérique indétectable, avait un MPA urinaire détectable, avec un niveau dans l'urine légèrement supérieur au seuil sérique (< 0,2 ng/mL). Nous avons détecté du MPA dans le sérum et l'urine de tous les participants 21 et 60 jours après l'injection.

Les résultats LC-MS/MS ont montré que tous les participants avaient au moins un moment où le LNG était détectable dans l'urine. Seuls huit des 15 participants avaient des niveaux détectables aux trois points de temps après la ligne de base (Fig. 2A). Six participants avaient des niveaux de LNG inférieurs au niveau de quantification au moment du creux (24 h après la dose 2), dont trois avaient également des niveaux indétectables six heures après leur première dose (Fig. 2A). Tous les participants sauf un avaient du LNG détecté par LC-MS/MS dans l'urine six heures après la troisième dose. Notamment, cet individu avait du LNG urinaire détecté après les premier et deuxième moments. Les niveaux réels de GNL pour tous les participants utilisant le LCMS/MS et l'EIA sont présentés dans le tableau 2S.

Le tableau 4 montre la détection LC–MS/MS du MPA dans des échantillons d'urine et de sérum pour les utilisateurs de MPA. Sur les 11 participants avec un MPA indétectable dans le sérum au départ, 10 avaient des échantillons avec un MPA indétectable dans l'urine, correspondant à une spécificité de 91 % avant la dose dans l'urine. Quatre personnes avaient du MPA détectable dans le sérum avant de recevoir leur injection (Fig. 2C), dont deux avaient également du MPA détectable dans l'urine. Les deux individus avec MPA détecté à la fois dans le sérum et l'urine ont nié toute injection antérieure de DMPA. Les deux participants avec un MPA urinaire indétectable mais un MPA sérique détectable avaient des niveaux inférieurs à ceux requis pour l'efficacité contraceptive (< 0,2 ng/mL). Ils ont déclaré avoir reçu des injections de DMPA plus de 12 mois avant le début de l'étude (15 et 17 mois, respectivement). L'individu avec un MPA sérique indétectable avait un MPA urinaire détectable, avec un niveau dans l'urine légèrement supérieur au seuil sérique (< 0,2 ng/mL). Nous avons détecté du MPA dans le sérum et l'urine de tous les participants 21 et 60 jours après l'injection (sensibilité de 100 %). Dans le tableau 3S, nous avons illustré les niveaux réels de MPA pour tous les participants utilisant LC-MS/MS.

Notre analyse du séquençage de l'ARN des échantillons de salive des participants ayant utilisé le DMPA a révélé un nombre variable de DEG aux trois moments (tableau 5). Les informations contenues dans les cartes thermiques bi-clustering (Fig. 3A – C) illustrent le profil visuel des DEG à partir d'échantillons obtenus aux jours 21 (D21) et 60 (D60) par rapport aux échantillons de référence (pré) et entre eux, triés par leurs valeurs de p ajustées et tracées avec leurs valeurs d'expression transformées en log2. Pour la comparaison pré-versus D21 (3a), nous avons observé 10 gènes exprimés de manière différentielle ; neuf de ces gènes ont été régulés positivement et un a été régulé négativement. Pour le pré- versus D60 (3b), nous avons vu cinq DEG ; un a été régulé à la baisse et quatre ont été régulés à la hausse. Pour la dernière comparaison entre D21 et D60 (3c), il y avait un total de 50 gènes exprimés de manière différentielle, dont 32 étaient régulés négativement et 18 étaient régulés positivement. Les parcelles de volcan de l'expression génique dans la salive des utilisateurs de DMPA en fonction du changement de pli et des valeurs p ajustées représentent les DEG à différents intervalles de temps (Fig. 4A – C). Nous avons répertorié les gènes différentiellement exprimés identifiés par leurs valeurs p ajustées ainsi que leurs erreurs standard et intervalles de confiance (IC) dans le tableau 4S. Nous n'avons pas détecté de gènes exprimés de manière différentielle dans les échantillons de salive des utilisateurs de COC par rapport au départ.

(A–C) Une carte thermique bi-clustering montrant le profil d'expression visuelle des principaux gènes exprimés de manière différentielle triés par leur valeur p ajustée en traçant leurs valeurs d'expression transformées log2 dans les échantillons (générées à l'aide du test de Wald). (A) montre la comparaison pré- versus D21 où nous avons observé 10 gènes exprimés de manière différentielle, dont neuf étaient régulés positivement et un était régulé négativement. (B) montre une comparaison pré-versus D60, nous avons vu cinq gènes exprimés de manière différentielle ; un a été régulé à la baisse et quatre ont été régulés à la hausse. (C) montre la dernière comparaison entre D21 et D60, il y avait un total de 50 gènes exprimés de manière différentielle, dont 32 étaient régulés négativement et 18 étaient régulés positivement.

(A–C) Volcano plots pour visualiser le profil d'expression des meilleurs gènes exprimés de manière différentielle triés par leur valeur p ajustée en traçant leurs valeurs d'expression transformées log2. Les DEG régulés à la baisse sont notés en rouge et les DEG régulés à la hausse sont notés en bleu.

Cette étude représente une nouvelle tentative dans le domaine de la contraception pour confirmer l'utilisation individuelle de méthodes hormonales en mesurant des biomarqueurs dans des échantillons d'urine et de salive. Nous avons pu démontrer que nous pouvions mesurer les hormones natives (LNG ou MPA) à de faibles concentrations dans l'urine à l'aide de LC-MS/MS) dans des échantillons obtenus de participants ayant utilisé des COC ou du DMPA. La sensibilité pour le LNG était de 93 % [68–100 %] à 6 h après l'administration au jour 3 et la sensibilité pour le MPA était de 100 % aux jours 21 et 60 ; la spécificité était de 91 % [59–100 %]. Nos résultats appuient fortement la poursuite de recherches supplémentaires pour confirmer nos conclusions concernant l'utilisation de l'échantillonnage d'urine pour identifier un biomarqueur de l'utilisation de contraceptifs hormonaux. Nous proposons de synthétiser les métabolites de référence présents dans l'urine pour le LNG et le MPA et de mesurer les concentrations de métabolites urinaires par LC-MS/MS. Les concentrations de métabolite(s) devraient être beaucoup plus élevées que les hormones intactes29,30,31, nous sommes donc convaincus que la mesure de métabolites urinaires spécifiques améliorera la sensibilité et la spécificité et favorisera le développement ultérieur de l'utilisation de l'échantillonnage d'urine comme biomarqueur de l'utilisation de contraceptifs hormonaux.

À notre connaissance, nos résultats sont les premiers qui démontrent la capacité de mesurer les concentrations de GNL dans des échantillons d'urine à l'aide du kit DetectX. Par rapport à nos résultats utilisant la technologie LC-MS/MS, les concentrations urinaires de GNL mesurées par EIA étaient beaucoup plus élevées. Ce résultat n'était pas surprenant car la méthode EIA LNG est basée sur des anticorps polyclonaux qui se lient à la fois au LNG et à ses métabolites. Nous devons confirmer si ce résultat EIA était dû à la réaction croisée des métabolites LNG présents dans l'urine avec les anticorps polyclonaux anti-LNG utilisés dans les kits DetectX et proposer de synthétiser le ou les métabolites de référence spécifiques pour valider davantage le kit LNG EIA pour une mesure correcte du LNG et des métabolites dans l'urine. De même, les métabolites de référence aideront à augmenter la sensibilité/spécificité de la mesure des métabolites dans l'urine par EIA, qui peut être une méthode plus rentable et accessible pour une utilisation dans les milieux à faibles ressources par rapport à la technologie LC-MS/MS.

Notre exploration des échantillons de salive fournit des preuves préliminaires que la salive pourrait être utilisée pour identifier un biomarqueur de l'utilisation de contraceptifs hormonaux. Sur la base de l'identification récente de l'expression génétique différentielle dans des échantillons de salive provenant de patients atteints de cancer, qui a ouvert la voie à l'exploration de la salive en tant que biomarqueur pour diverses conditions32,33,34, nous avons émis l'hypothèse que l'utilisation de contraceptifs hormonaux pourrait entraîner une augmentation ou une diminution régulation de certains gènes sélectifs chez les personnes utilisant le DMPA ou un COC. Comme illustré dans les cartes thermiques, nous avons trouvé de nombreux gènes exprimés de manière différentielle dans le groupe qui a utilisé le DMPA au jour 21 et au jour 60 par rapport à la ligne de base, dont la majorité ont été décrites précédemment en association avec diverses entités ou conditions pathologiques. Fait intéressant, dans notre étude, les changements que nous avons notés semblent correspondre aux effets indésirables signalés par certaines personnes lors de l'utilisation du DMPA. Le gain de poids35 et l'alopécie36, par exemple, sont rapportés chez certains utilisateurs de DMPA, et notre analyse de l'expression différentielle des gènes a montré que le gène CRTC (CREB-regulated transcription coactivator 3), qui joue un rôle dans l'obésité35 et PRMT9 (Protein Arginine Methyltransferase 9 ) qui a été associé à la dysostose mandibulofaciale avec alopécie étaient tous deux régulés à la hausse. De plus, nous avons identifié que la N-acétyltransférase1, qui fonctionne dans le catabolisme des folates37,38, était régulée à la baisse. Cette constatation est conforme à un rapport des Centers for Disease Control notant que les utilisateurs de DMPA sont susceptibles d'être classés dans le quartile le plus bas (≤ 6,2 ng/mL) pour les concentrations sériques de folate39. Nous avons également identifié que la protéine de liaison à la galectine-3 lgals3bp, qui est considérée comme un biomarqueur tumoral clinique important40,41,42, était régulée négativement chez les utilisateurs de DMPA. Fait intéressant, il a été rapporté que l'utilisation du DMPA induit une diminution spectaculaire de la prolifération épithéliale de l'endomètre et est même suggérée comme agent chimio-préventif chez les personnes atteintes du syndrome de Lynch43. D'autres études de confirmation sont nécessaires pour démontrer si l'un de ces gènes à expression différentielle identifiés pour ces autres conditions pourrait également servir de biomarqueur dans la salive des utilisateurs de DMPA.

En revanche, nous n'avons détecté aucune expression génique différentielle dans les échantillons de salive d'utilisateurs de COC collectés 24 et 72 heures après l'ingestion. Le résultat négatif pourrait être dû aux délais courts et aux séquences que nous avons suivies pour l'échantillonnage de la salive des utilisateurs de COC. Il est probable que les changements dans les niveaux d'ARNm chez les utilisateurs de COC étaient relativement faibles après seulement 24 et 72 h d'utilisation. La capacité d'évaluer avec précision la présence d'hormones dans la salive dépend de la nature biochimique des hormones et du mécanisme par lequel les hormones, par exemple le LNG, pénètrent dans la cavité buccale44,45. Par conséquent, les modifications génétiques indétectables chez les utilisateurs de COC après 24 à 72 h d'utilisation peuvent avoir été liées au mécanisme de transport spécifique du GNL dans la salive, qui doit être exploré plus avant.

De plus, dans cette étude, nous n'avons effectué que le séquençage de l'ARN total qui détecte principalement l'ARN codant. Les résultats d'études récentes ont démontré que l'ARN long non codant et le micro-ARN peuvent interagir par divers mécanismes pour réguler l'ARNm46. Les efforts de recherche futurs dans lesquels nous appliquons de plus longues périodes d'utilisation de COC (et des temps de collecte de salive) ainsi que le séquençage de microARN qui interrogent des milliers de petites séquences d'ARN non codantes avec une sensibilité sans précédent pourraient nous permettre d'identifier des gènes exprimés de manière différentielle chez les utilisateurs de COC.

Cette étude avait plusieurs forces ainsi que des limites. Nos résultats démontrant que l'échantillonnage d'urine peut être utilisé pour identifier un biomarqueur de l'utilisation de contraceptifs hormonaux ont ouvert la voie à un développement ultérieur, y compris une voie vers l'identification de méthodes de diagnostic utilisant l'échantillonnage d'urine qui peuvent être appliquées facilement et largement. Le fait que nous n'ayons pas utilisé la technologie de dérivatisation pour mesurer les niveaux d'hormones était une limite de l'étude. Avec cette méthode, il est probable que nous aurions pu augmenter la détection de niveaux inférieurs d'hormones dans les échantillons d'urine et avoir amélioré la sensibilité de nos résultats pour détecter à la fois l'utilisation de COC et de DMPA. Une autre limite était que nous n'avions pas mesuré les taux sanguins de base de LNG/MPA des volontaires avant de commencer le traitement avec les COC ou le DMPA. Ces points de données auraient pu améliorer nos résultats de spécificité obtenus à partir des échantillons d'urine.

En ce qui concerne nos résultats avec la salive, nos résultats positifs chez les utilisatrices de DMPA suggèrent que nous pourrions être en mesure d'utiliser ce liquide corporel facilement obtenu pour identifier le(s) biomarqueur(s) de l'utilisation de contraceptifs hormonaux. L'utilisation de la technologie de séquençage de l'ARN uniquement pour cette phase de l'étude peut nous avoir empêché de montrer une expression différentielle dans la salive des utilisateurs de COC et était une faiblesse de l'étude. De plus, il est possible que les changements dans l'expression des gènes salivaires soient cumulatifs, et donc le court laps de temps que nous avons utilisé pour explorer ces changements représentait une faiblesse supplémentaire. Nous devrons mener des recherches supplémentaires pour évaluer les effets d'une exposition plus longue à l'utilisation de COC sur l'expression différentielle des gènes, et appliquer le séquençage de micro-ARN pour obtenir des informations supplémentaires afin de déterminer si une exploration plus approfondie est justifiée pour utiliser l'échantillonnage de salive pour détecter les biomarqueurs de l'utilisation de COC.

Dans l'ensemble, les possibilités soulevées par nos résultats suggèrent que nous pourrions être en mesure d'utiliser l'urine ou la salive pour développer de nouveaux biomarqueurs indicatifs de l'utilisation de contraceptifs hormonaux qui pourraient être appliqués dans la recherche en santé publique et avoir également des implications pour la recherche clinique et les soins cliniques.

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Cette étude a été soutenue par un sous-accord de l'Université Johns Hopkins avec des fonds fournis dans le cadre de la subvention n° OPP1172551 (amélioration de la mesure et de la conception des programmes) de la Fondation Bill et Melinda Gates. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de la Fondation Bill et Melinda Gates ou de l'Université Johns Hopkins. Nous sommes reconnaissants au Dr George Creasy pour ses conseils sur l'élaboration du protocole et le suivi médical de l'essai ; au Dr Lisa Haddad pour son examen minutieux et l'édition de plusieurs ébauches du manuscrit ; à Lorna Begg pour son aide avec le formatage final ; et à Craig Savel et Divea Venkatasetty pour leur aide à la gestion des données. Nous tenons à remercier les 30 femmes qui ont participé à l'étude.

Centre de recherche biomédicale, Population Council, 1230 York Avenue, New York, NY, 10065, États-Unis

Rakhee Sachdeva, Narender Kumar, Barbara A. Friedland, Marlena Plagianos, Shimin Zhang, Larisa Kizima et Ruth B. Merkatz

Clinique Profamilia, Nicolas de Ovando Esq Calle 16, Ens. Luperon, Saint-Domingue, République dominicaine

Vivian Brache, Leila Cochon & Ana Sofía Tejada Tabar

Canyon d'or, États-Unis

Anne Blanc

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RS a conceptualisé et planifié les expériences utilisant la salive comme biomarqueur pour l'utilisation de contraceptifs, organisé les données des échantillons de salive, analysé les données EIA et LCMS pour l'urine et le sérum et rédigé/édité les sections techniques du manuscrit. NK a conceptualisé et planifié les expériences utilisant l'urine comme biomarqueur pour l'utilisation de contraceptifs hormonaux, a supervisé et organisé les résultats pour le LNG et le MPA à partir d'échantillons de sérum et d'urine, a contribué au développement du protocole et a écrit/édité les sections techniques du manuscrit. VB a mené et supervisé la collecte de données, y compris les procédures de recrutement et de consentement éclairé en tant que chercheur principal sur le site clinique. BF a co-écrit le protocole de l'étude, formé le personnel de l'étude, effectué la surveillance (à distance) du site clinique conformément aux bonnes pratiques cliniques et contribué à la rédaction/édition du manuscrit. MP a élaboré des plans de gestion des données et d'analyse statistique, examiné toutes les données du site clinique et développé, effectué des analyses de sensibilité et de spécificité pour les données sériques et urinaires, et contribué à la rédaction/édition du manuscrit. SZ a analysé tous les échantillons de COC et de MPA en utilisant LCMS/MS. LK a effectué toutes les expériences EIA sur tous les échantillons d'urine. LC a effectué des procédures avec des volontaires de l'étude sur le site de l'étude et a manipulé tous les échantillons comme indiqué par le protocole. AST a effectué des procédures avec des volontaires de l'étude sur le site de l'étude et a manipulé tous les échantillons comme indiqué par le protocole. AB a initié l'exploration de biomarqueurs pour l'utilisation de contraceptifs hormonaux, a obtenu le financement de l'étude et a contribué à l'élaboration du protocole. RBM a conceptualisé et co-développé l'étude et le protocole d'étude, assuré la supervision du projet et rédigé la majeure partie du manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Ruth B. Merkatz.

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Réimpressions et autorisations

Sachdeva, R., Kumar, N., Brache, V. et al. Nouvelles approches pour développer des biomarqueurs de l'utilisation de contraceptifs hormonaux. Sci Rep 13, 245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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Reçu : 10 décembre 2021

Accepté : 11 novembre 2022

Publié: 05 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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